彭海琳课题组与合作者报道自组装超结构电镜载网抑制冷冻制样中的气液界面效应

近日，北京大学彭海琳课题组与合作者发表了题为“Self-assembled superstructure alleviates air-water interface effect in cryo-EM”的研究论文(Nature Commun.2024, 15, 7300)，报道了基于石墨烯-硬脂酸分子自组装层复合结构(GSAMs)的冷冻电镜载网，该复合结构在冷冻制样时显著抑制了生物蛋白分子因吸附在气液界面而导致的结构变性和优势取向问题。同时，GSAMs能显著丰富蛋白分子在无定形冰中的取向，有利于实现单颗粒冷冻电镜的高分辨结构解析。通过GSAMs，研究团队成功实现多种蛋白近原子级分辨率的三维结构解析。

图1 GSAMs复合膜在冷冻电镜成像中的优势：减轻气液界面吸附与丰富样品取向

单颗粒冷冻电镜是目前揭示生物大分子精细结构和反应机理的重要手段之一。在冷冻电镜成像过程中，生物大分子被封装在薄层玻璃态冰中，在电子束辐照下，仍处于原始结构和本征状态。然而对于蛋白质而言，绝大多数蛋白质颗粒在冷冻制样时均倾向于吸附在空气-液体的界面处。吸附在气液界面的样品容易发生结构变性，并产生单一的优势取向，严重制约蛋白质的高分辨结构解析。为解决这个难题，业内通常引入一层无定形碳膜以避免气液界面问题，但是无定形碳膜厚度高达3 nm，在电镜下背景噪音大，并且电子辐照时会产生较大的样品漂移，显著降低成像质量。

近年来，北京大学彭海琳课题组致力于开发单原子层厚度的石墨烯功能薄膜及其电镜载网技术，清华大学王宏伟课题组致力于发展新型冷冻电镜成像方法及机理研究。双方强强联合，基于悬空石墨烯功能膜解决冷冻电镜成像存在的气液界面、优势取向、冰层控制、样品飘移等问题，以提升冷冻电镜成像分辨率，取得了一系列研究成果(Adv. Mater. 2017; Structure 2017; J. Am. Chem. Soc. 2019; Nature Commun. 2019; Nature Commun. 2020; Biophysics Reports 2021; ACS Nano 2021; Nature Commun. 2022; Nat. Methods 2023; J. Am. Chem. Soc. 2023)。2024年1月，王宏伟课题组和彭海琳课题组进一步合作开发了一种基于石墨烯“三明治”结构的冷冻电镜生物样品制备方法，以“石墨烯三明治技术用以生物冷冻电镜结构解析”（Graphene sandwich-based biological specimen preparation for cryo-EM analysis）为题发表在PNAS 2024,121(5), e2309384121期刊上。该研究通过两层石墨烯对生物样品溶液进行封装，制备冰层厚度适宜的石墨烯“三明治”样品用于高分辨冷冻电镜重构。生物大分子被封装在两层石墨烯薄膜之间，从而彻底避免了气液界面的影响。并且由于石墨烯优异的机械强度和导电性能，该方法还可以有效抑制冰层形变，降低电镜成像过程中的颗粒漂移和冷冻样品在透射电镜下的电荷积累效应，从而进一步提高冷冻电镜照片的质量。该工作被Nature Methods作为亮点进行报道(Graphene sandwich for cryo-EM)。

图2 “石墨烯三明治结构”冷冻电镜样品制备示意图(PNAS2024,121, e2309384121)

在最新的研究工作中(Nature Commun. 2024, 15, 7300)，研究团队基于硬脂酸分子在石墨烯表面的自组装行为，获得液面上自支撑的大面积石墨烯薄膜，即GSAMs，制得的石墨烯电镜载网能有效抑制冷冻电镜制样中的气液界面效应。该方法简单易行，且避免了传统的高分子辅助转移法带来的污染。基于此，研究团队实现了悬空石墨烯电镜支撑膜的批量制备，其悬空膜完整度高达99.5%。通过扫描隧道显微镜(STM)、冷冻电镜等表征手段，以及DFT理论计算，研究团队确定了硬脂酸分子的自组装结构：两个硬脂酸分子的羧基通过分子间氢键连接成环，形成二聚体后实现规则排列。紧接着，研究团队将GSAMs载网用于冷冻电镜成像中，发现GSAMs复合膜提供了与蛋白分子相互作用的界面，因此该复合结构对蛋白具有“锚定”作用，在负载时能显著降低蛋白吸附在气液界面的比例。同时，研究团队将GSAMs与冷冻电镜成像常用的表面活性剂添加剂进行对比，发现GSAMs能更好地提高蛋白分子在冰层中的浓度及取向，有利于高效率、高分辨的三维重构。综合以上优势，研究团队利用GSAMs载网对多种不同尺度的蛋白进行了冷冻电镜的高分辨结构解析，包括2.6 Å分辨率的链霉亲和素(streptavidin, 52 kDa)、3.3 Å分辨率的人体血管紧张素转换酶2-新冠病毒刺突蛋白受体结合结构域复合体(ACE2-RBD, 100 kDa)以及2.0 Å分辨率的20S蛋白酶体(20S proteasome, 690 kDa)等。

图3 GSAMs超结构的制备与表征

图4 GSAMs复合膜显著提高冷冻电镜成像质量，成功解析多种蛋白的高分辨三维结构

该研究工作中(Nature Commun. 2024, 15, 7300)，北京大学彭海琳教授、清华大学生命科学学院王宏伟教授、刘楠博士以及深圳理工大学赵超博士为论文共同通讯作者，北京大学化学学院博雅博士后郑黎明、清华大学生命科学学院博士生徐洁、中国航天科技创新研究院王伟华博士与北京大学化学学院博士生高啸寅为论文共同第一作者。北京大学化学学院刘忠范教授团队、吴凯教授/周雄研究员团队等为重要合作者。

该工作得到国家自然科学基金、国家重大科学研究计划、北京分子科学国家研究中心、北京生物结构前沿研究中心、清华-北大生命科学联合中心、中国博士后科学基金、腾讯基金会等资助，并得到了北京石墨烯研究院、水木未来科技有限公司、北京大学化学与分子工程学院的分子材料与纳米加工实验室（MMNL）仪器平台的支持。

论文链接1：https://www.nature.com/articles/s41467-024-51696-w

论文链接2：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2309384121

论文链接3：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02219-4