Analytical Chemistry：升级版点亮型生物检测平台：熵驱动催化电路操纵氧化石墨烯表面新型DNA银纳米簇的构型转化

背景介绍

由于DNA银纳米簇具有易合成、成本低、水溶性好和毒性低等优点，掀起了广泛的研究热潮。有趣的是，通过调节模板DNA的长度、碱基序列和结构能够精准调控DNA银纳米簇（DNA-Ag NCs）的光学性质。其中，DNA发夹被广泛用于合成银纳米簇由于他们特定的二级结构。例如，Shah等人报道了以含有6-碱基胞嘧啶环 （6C-loop）的发夹DNA为模板成功合成出具有强荧光发射的DNA-Ag NCs。然而，当目标物miRNA互补杂交而破坏发夹结构时，DNA-Ag NCs的荧光降低。基于此，他们构建了一个快速、简单、“开-关”型miRNA检测方法 （图1A）。但是，这种“开-关”型检测机制很难精准区分和定量荧光的降低。

图1. (A) 传统基于6-C环发夹DNA-Ag NCs构建的“开-关”型检测方法。（B）基于新型DNA-Ag NCs构建的“关-开”型检测方法。（C）低背景、强荧光、升级版“关-开”型检测平台。（来源：Anal. Chem.）

近期，扬州大学李静讲师、徐琴教授以及湖南大学黄晋教授发现以6C-环发夹结构为模板能够合成出发暗光的银纳米簇。有趣的是，当发夹结构被互补DNA打开时，发暗光的银纳米簇能够发射出很强的红色荧光（图1B）。这种有趣的发现鼓励他们构建一种激活式“关-开”型荧光检测平台解决传统“开-关”型检测机制面临的问题。但是，基于“一对一”信号触发模式即一个目标物产生一个信号，会面临检测灵敏度不足的问题。熵驱动催化电路（entropy-driven catalysis circuit）被认为是一种独特、有效的DNA放大器，它能够被少量的目标分子激活，随后在燃料链（Fuel）的驱动下自动循环，产生大量的输出链，实现信号的富集和增强。

基于此，以氧化石墨烯（GO）作为荧光猝灭剂，进一步降低暗DNA-Ag NCs自身的背景荧光，利用熵驱动催化电路（EDCC）精准调控GO表面DNA-AG NCs由吸附到解吸的构型转变，构建了一种升级版点亮型生物检测平台（EDCC-Ag NCs/GO），实现了DNA-Ag NCs由“关”到“开”的高对比度荧光转化 (图1C)。相关研究成果以“Upgraded and Light-Up Biosensing Platform: Entropy-Driven Catalysis Circuit Manipulates the Configuration Transformation of Novel DNA Silver Nanoclusters on the Graphene Oxide Surface”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.4c01338）。

研究的主要内容介绍

EDCC调控GO表面DNA-Ag NCs的机理

通过退火形成6C-环发夹结构，由于Ag⁺对6C-环的高亲和力，Ag⁺被捕获而结合在发夹6C环中，通过NaBH₄还原合成暗DNA-Ag NCs（图2A）。有趣的是，当发夹结构被互补DNA打开时，合成的暗Ag NCs能够发射强的红色荧光（图2B）。为了获得低的背景、高的检测灵敏度，GO用于猝灭暗Ag NCs的固有荧光背景。同时，利用EDCC循环靶标用于信号放大，并且调控GO表面DNA-Ag NCs由吸附到解吸的构型转变，现实高对比度“关”到“开”荧光转化。如图2C所示，暗Ag NCs通过π-π堆积作用吸附到GO的表面导致其固有荧光被猝灭。此时，一个目标物激活的EDCC反应发生，释放出Ag NCs的互补DNA（P2）。具体地，EDCC底物由L, P1和P2组成，其中L含有两个粘性末端（toehold 1和toehold 2）。在初始状态下，toehold 2被P1封闭处于失活的状态。然而，当目标物T存在的时候，它能够特异性地识别toehold 1去置换P1，导致toehold 2的暴露。随后，加入F链与新暴露的toehold 2 结合，同时释放出P2和T。结果，生成的T参与下一轮的循环反应，产生大量的P2与GO表面的Ag NCs杂交。由于双链DNA对GO低的亲和力，猝灭的Ag NCs从GO表面解吸，产生显著增强的红色荧光。

图2. (A) 暗DNA-Ag NCs的合成（B）暗DNA-Ag NCs变成强红色发射的纳米簇的转化机理（C）基于EDCC调控GO表面DNA-Ag NCs构型转变而构建的升级版“关-开”型检测平台。（来源：Anal. Chem.）

新型发夹结构DNA-Ag NCs的制备和表征

由于胞嘧啶对Ag⁺的高亲和力，Ag⁺被嵌入到发夹模板的环部，通过NaBH₄还原成暗的Ag NCs （图3A）。TEM成像（图3B）表明，新型Ag NCs具有好的分散性、均一的尺寸，平均粒径大约是2 nm（图3C）。同时，新型DNA-Ag NCs的荧光发射依赖于激发波长（图3D）。CIE1931色度坐标计算表明DNA-Ag NCs的发射在红色区域（图3E）。有趣的是，当发夹结构被P2打开时，暗Ag NCs的荧光强度显著增强（图3F），该现象可以通过UV-vis吸收光谱和荧光光谱验证。如图1G所示，暗Ag NCs在550 nm具有极其微弱的吸收（黑线），然而当发夹结构被P2打开时，在580 nm具有很强的吸收（红线）。同时，图1H再次表明，暗Ag NCs具有弱的激发（红线）和弱的发射（黑线），而加入互补链P2后，其Ag NCs在580 nm的激发（绿线）和660 nm的发射（蓝线）显著增强，进一步支持了UV-vis吸收光谱的结果。上述实验结果表明，暗Ag NCs被成功合成，并且当发夹结构被互补DNA（P2）打开时其荧光被显著地点亮。

图3.（A）暗Ag NCs的制备。（B）和（C）暗Ag NCs的TEM图和相应的尺寸统计图。（D）暗Ag NCs的激发和发射三维关系图。（E）暗Ag NCs的CIE1931色度坐标计算图。（F）暗Ag NCs向强红色发射纳米簇转化机理。（G）和（H）分别是暗Ag NCs的UV-vis吸收光谱以及激发和发射光谱。（来源：Anal. Chem.）

作为一个罕见案例，我们探究了发夹茎部长度对荧光特征的影响。不同茎部长度的发夹序列如图4A所示，随着发夹茎部长度从4 bp到10 bp，暗Ag NCs的自发荧光逐渐增强。然而，当发夹茎部进一步延长到12 bp，暗Ag NCs的自发荧光产生降低的趋势（图4B），与先前Guo等人报道的一致。随后，利用互补DNA（P2）打开Ag NCs的发夹结构（图4C），Ag NCs的荧光并没有明显的降低。相反，当发夹结构破坏以后，Ag NCs的荧光表现出增强的趋势。尤其，当茎部长度为8 bp的发夹结构被打开时，Ag NCs表现出显著的荧光增强（图4D）。我们推测产生该现象的原因可能是：第一，Ag NCs是嵌入发夹的6C-环中，因此，一个稳定的发夹结构具有高的Tm值可能有利于红色纳米簇的形成。第二，当发夹被互补DNA打开时，Ag链5’端的某些碱基（例如，G碱基）对于荧光增强起到一个重要的作用通过富G诱导的邻近增强。由于有限的数据和参考文献，详细的机制并没有一个清楚的解释，但是未来它可能会引发一些新的发现。

图4. 考察发夹茎部长度对Ag NCs荧光性质的影响。（A，C）不同茎部长度的发夹DNA被互补DNA（P2）打开前后的序列信息。（B，D）加入互补DNA（P2）前后Ag NCs的荧光变化。（来源：Anal. Chem.）

EDCC调控GO表面DNA-Ag NCs从吸附到解吸构型转变的可行性分析

鉴于这一有趣的发现，我们构建了一个升级版“关-开”型荧光传感器用于灵敏检测H5N1 DNA。图5A展示了EDCC的操作机理，只有当T取代P1暴露toehold 2时，F才能与L结合。否则，F不能直接与L杂交释放P2。如图5B所示，泳道I-4分别代表L, P2, T和F，泳道5是EDCC底物（L/P1/P2），泳道7是L/T/P2，泳道10是L/F双链。当T加入到EDCC底物时，（L/P1/P2）条带消失，出现了一条类似于（L/T/P2）的条带。当T和F同时加入到EDCC底物时，在泳道9中发现了类似于（L/F）的明亮条带。然而，当F单独加入到EDCC底物时，在泳道8中几乎观察不到L/F条带，表明EDCC反应是可行的。

此外，随着GO浓度的增加，暗Ag NCs的荧光强度逐渐被猝灭，其最佳浓度为6 µg/mL（图5C）。随后，我们探究了EDCC调控GO表面Ag NCs从吸附到解吸构型转变情况。如图5D，当没有T时，荧光强度极其微弱（绿线），然而当T加入到EDCC-Ag NCs/GO体系时，大约有26倍的荧光增强（红线）。上述实验结果表明，GO能有效猝灭暗Ag NCs的固有荧光，EDCC能够精准调节GO表面Ag NCs从吸附到解吸的构型转变，进而实现高信背比和高对比度的“关-开”型荧光转变。

图5. （A）EDCC反应的优先性示意图。（B）EDCC反应中每一步链置换反应的PAGE成像图。（C）探究GO浓度对暗Ag NCs荧光强度的影响。（D）EDCC调控GO表面Ag NCs从吸附到解吸构型转变的可行性分析。（来源：Anal. Chem.）

EDCC-Ag NCs/GO体系检测性能评估

如图6A，B所示，不断加入H5N1 DNA导致EDCC-Ag NCs/GO的荧光变化逐渐增加。EDCC-Ag NCs/GO的荧光变化与H5N1 DNA浓度对数具有一个良好的线性关系，其定量方程为（F-F₀）/F₀=0.463logC_H5N1+0.105 (图6C)。经计算，其检测限为0.40 pM。

随后，考察了EDCC-Ag NCs/GO检测平台对H5N1 DNA的选择性，选择不同碱基错配的DNA序列以及随机DNA序列作为可能的干扰物（图6D）。如图6E，F所示，当H5N1 DNA存在时，EDCC-Ag NCs/GO的荧光变化（F-F₀）/F₀显著增强，然而干扰物的荧光变化处于很低的水平。实验结果表明，EDCC-Ag NCs/GO检测平台能够特异性地识别H5N1 DNA，具有区分单碱基错配的能力。

EDCC-Ag NCs/GO检测平台在生物样本中的应用

鉴于传感器良好的检测性能，进一步探究了EDCC-Ag NCs/GO在生物样本中检测H5N1 DNA的实际应用能力。首先，在复杂环境下，考察了EDCC-Ag NCs/GO的稳定性和重现性。如图6G所示，在不同实验条件下，EDCC-Ag NCs/GO的荧光变化没有明显的差异。相反，当向缓冲体系（图6H）和人血清样本（图6I）中加入不同浓度的H5N1 DNA时，EDCC-Ag NCs/GO的荧光变化逐渐增强。此外，通过向稀释的人血清样本中加入不同浓度的H5N1 DNA进行加标回收实验，H5N1 DNA的回收率在92.65%到107.3%之间，其相对平均偏差在2.05%到3.44%之间，结果表明升级版“关-开”型检测平台具有好的稳定性、高的可靠性和令人满意的回收率，在生物和医学应用方面具有巨大的潜力。

图6.（A）EDCC–Ag NCs/GO 对不同浓度H5N1 DNA的荧光响应光谱图。（B）EDCC–Ag NCs/GO的荧光强度随H5N1 DNA浓度的变化。（C）EDCC–Ag NCs/GO的荧光变化与H5N1 DNA浓度对数的线性拟合曲线。（D）不同碱基错配的DNA序列信息。EDCC–Ag NCs/GO响应H5N1 DNA和干扰物的荧光光谱图（E）和相应的柱状图（F）。EDCC–Ag NCs/GO在不同环境下，稳定性和可靠性分析（G）和及相应的热图（H和I）。（来源：Anal. Chem.）

小结

以含有6C-环的发夹结构的DNA为模板成功合成暗Ag NCs。有意思的是，当发夹结构被互补DNA打开时，暗Ag NCs可以被点亮发射强的红色荧光。基于此，首次构建了一个低背景、高荧光和点亮型生物检测平台（EDCC-Ag NCs/GO），该平台采用EDCC精准调控GO表面DNA Ag NCs从吸附到解吸的构型转变。得益于GO的有效猝灭和EDCC的固有信号放大能力，该检测平台具有较高的信背比（26倍）和较低的检测限（0.40 pM）。同时，EDCC-Ag NCs/GO在缓冲溶液和人血清样本中表现出良好的特异性、稳定性和可靠性。重要的是，EDCC-Ag NCs/GO生物检测平台在人血清样本中具有令人满意的回收率，有望成为一种构建实时成像和生物分析等生物传感平台的有利工具。