用户文章丨《Frontiers in Microbiology》一种新的石墨烯量子点探针用于环境偶氮呼吸活性菌的分离

环境中存在大量功能未知，种属未知的为培养微生物，特定的功能微生物的鉴定、分离、培养对于构建生物资源库和环境生物修复是必要的。本文将分享由广东省科学院微生物研究所许玫英老师团队应用长光辰英核心产品—— PRECI SCS单细胞分选仪在《Frontiers in Microbiology》期刊上发表的题为“Function-Oriented Graphene Quantum Dots Probe for Single Cell in situ Sorting of Active Microorganisms in Environmental Samples”的论文，该研究通过自下而上的方法制备了可用于荧光共振能量转移（FRET）的石墨烯量子点探针（GQD-M），并证实了该探针在识别环境样品中偶氮降解功能菌方面的作用。

一、研究背景

环境中存在大量功能未知，种属未知的为培养微生物，特定的功能微生物的鉴定、分离、培养对于构建生物资源库和环境生物修复是必要的。传统用于检测和分类功能细菌的经典方法非常耗时，需要数天甚至数周的时间来筛选或在选择性培养基中富集目标菌株。研究团队早期提出了采用探针结合荧光激活细胞分选来检测和筛选具有降解功能的细菌，在本研究中开发了一种石墨烯量子点探针，结合荧光共振能量转移原理筛选环境中的偶氮降解功能菌。

二、实验方法

石墨烯量子点探针GQDs-M的制备是建立在氮掺杂GQDs（GQDs-N）的基础上，先通过自下而上策略制备GQDs- N探针，该探针在紫外照射(365 nm)下显示绿色荧光。通过向GQDs- N上连接了甲基红（含偶氮基），得到GQDs-M探针。根据FRET原理，GQDs- N发出的绿色荧光被甲基红吸收（波段重叠），使得GQDs-M在紫外照射下并不呈现荧光。另一方面，在紫外照射下，由于甲基红本身含偶氮基，被偶氮降解微生物结合后会释放GQDs- N的绿色荧光，以此来筛选环境中的偶氮活性菌。通过GQDs-M探针，研究团队从水体及沉积物中使用HOOKE PRECI SCS单细胞分选仪筛选培养了17株偶氮降解活性菌，属于8个不同的种属，证实了该探针在环境偶氮降解功能菌筛选中的作用。

图1 GQDs-M制备方法及环境偶氮降解菌筛分流程

三、结果

1.GQDs-M探针可用于偶氮降解微生物FRET检测

文章采用自下而上的合成方式制备了含N的石墨烯量子探针（GQDs-N），并在该探针基础上与商业偶氮染料甲基红结合形成GQDs-M探针。接着，文章对两个探针的物理属性进行了验证。为确定GQDs-M探针能够通过FRET原理进行偶氮降解菌的筛选，文章中采用了阳性对照菌（脱色希瓦氏菌S12），阴性对照菌（大肠杆菌）和Bosea thiooxidans BI-42等其他几类之前报道中的偶氮降解菌进行了GQDs-M探针的荧光验证（图2a-f）。确认GQDs-M探针功能后，文章对该探针在人为混合的微生物群中进行了模拟（图2g-i），并进一步采用环境水体样品进行了验证（图2j-l）。

图2 GQDs-M在微生物中的应用

a-c：明场通道，荧光通道及合并通道中S12-GQDs-M的成像效果；d-f：明场通道，荧光通道及合并通道中BI-42-GQDs-M的成像效果；g-i：明场通道，荧光通道及合并通道中人工微生物群落（含脱色希瓦氏菌S12，大肠杆菌，C1）-GQDs-M的成像效果；j-l：明场通道，荧光通道及合并通道中环境样品-GQDs-M的成像效果

2. 环境偶氮降解菌的筛选及分离培养

文章在验证GQDs-M探针在环境中能够区分普通菌与偶氮降解菌后，利用环境样品完善了偶氮降解菌的分离培养流程。将环境样品与GQDs-M探针共孵育后，采用PRECI SCS单细胞分选仪对产生荧光的偶氮降解活性菌进行了分离培养，从21个样品组中分离培养了17株可培养菌（LB培养基），并进行了16s rRNA基因测序，17株可培养菌共分为8个不同种属。

图3 环境样品单细胞分选

a,d：分选芯片上环境样品荧光成像；b,e：分选前芯片上环境样品明场成像；c,f：分选后芯片上环境样品明场成像；g,h：分选菌株S1A1明场及荧光成像；i,j：分选菌株RCA明场及荧光成像

综上所述，所有被分选的细菌都表现出偶氮降解功能，表明GQDs-M是一种功能导向探针，GQDs-M与PRECI SCS单细胞分选仪相结合的单细胞分选策略灵敏度和准确性达到100%。

该研究利用GQDs和甲基红构建了FRET探针GQDs-M。GQDs-M专门针对能够降解偶氮染料的细菌，但理论上如果相应的FRET机制匹配合适，该文章的方法可以推广至其他具有特定呼吸代谢功能的微生物群落中。

四、结论

本研究自下而上合成了含氮的石墨烯量子点探针GQDs-N，它具有高量子产率、长期光学稳定性和酸碱稳定性等优异的光学性能。通过修饰GQDs-N表面结合甲基红偶氮染料得到GQDs-M探针，其光学性质构成了一个荧光开关，可作为特异性探针准确识别具有偶氮呼吸活性的细菌。GQDs-M与HOOKE PRECI SCS单细胞分选仪相结合，为环境样品中偶氮呼吸微生物的快速、敏感和精确的单细胞筛选提供了一种物种独立、培养独立和功能导向的方法。该策略可为从环境中分离出各种功能菌和功能菌新种或高活性种提供一种替代方法。

原文链接：https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.659111

五、辰英价值

PRECI SCS微生物单细胞分选仪基于激光诱导向前转移（Laser induced forward transfer, LIFT）技术，能精准分离复杂生物样本中的单个细胞。PRECI SCS不仅具有直观的分选功能，还能通过HOOKE IntP智能软件实现单细胞的智能识别、一键自动分选和全自动细胞收集，在单细胞尺度上实现真正的“所见即所得”，操作简便且应用广泛。

六、研究团队介绍

许玫英，博士，研究员，博士生导师。国家级人才，国家优青(2014)、国务院政府特殊津贴(2012)、广东省丁颖科技奖(2017)、中国环境科学学会“青年科技奖”（2010）和“优秀环境科技工作者奖”（2014）、广东“五四青年奖章”（2005）获得者等。

长期致力于环境微生物学研究，在微生物治理环境污染理论和技术研究中取得多项创新性科研成果。先后承担了“973”、“863”、国家自然科学基金重点项目等40多项国家和省部级科研项目，构建了微生物生态网络调控响应研究体系，发现了多种电活性微生物新型代谢及电子传递机制，挖掘到多种有毒有机物的降解基因元件；利用合成生物学技术，构建了多个高效降解功能微生物组，发明了多项毒害性有机污染物的微生物强化降解技术。

已发表研究论文200多篇，SCI收录论文130多篇，其中第一和通讯作者论文90多篇，包括微生物学和环境工程领域顶级期刊Nat Commun、ISME J、Environ Sci Technol等；已申请国家发明专利90多件，获授权中国发明专利56项、美国专利1件。作为主要技术负责人完成了多项水污染微生物强化治理工程，其中以第一完成人获广东省科学技术奖一等奖（2018）、二等奖（2014）各1项。相关成果被Science等权威刊物多次正面引用和评价，取得显著的社会、经济和生态效益。