RB 速递 | 天津大学冯亚凯教授和青海民族大学朵兴红副教授团队共同研究成果：聚乙烯亚胺修饰的石墨烯量子点可促进内皮细胞增殖

摘要

图形摘要：聚乙烯亚胺修饰的石墨烯量子点可促进内皮细胞增殖

天津大学冯亚凯教授和青海民族大学朵兴红副教授团队共同研究成果：

内皮细胞增殖在血管生成和相关疾病的治疗中发挥着重要作用。本研究旨在评估聚乙烯亚胺（PEI）修饰的石墨烯量子点（GQDs）基因载体对内皮细胞增殖的影响。通过酰胺化反应合成了 GQDs 阳离子聚合物基因载体，并将其用于向人脐静脉内皮细胞（HUVECs）传递 pZNF580 基因以促进其增殖。GQDs 的化学修饰可以调整基因载体的表面性质和电荷分布，从而增强其与基因分子的相互作用，有效地压缩 pZNF580 基因。CCK-8检测显示，在较高载体浓度（40 μg/mL）下，细胞存活率高于80%，表明GQDs阳离子聚合物基因载体及其基因复合纳米颗粒具有较低的细胞毒性。活/死细胞双染色检测结果与 CCK-8 检测结果一致，A-GQDs/pZNF580（94.38±6.39%）、C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580（98.65±6.60%）和 N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580 （90.08±1.60%）组明显高于 Lipo2000/pZNF580（71.98±3.53%）阳性处理组。转染和 Western 印迹实验结果表明，载体能显著增强质粒向 HUVEC 的递送，提高 pZNF580 在 HUVEC 中的表达。此外，基因纳米颗粒还能更好地促进内皮细胞的迁移和增殖。C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580 处理组和 N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580 处理组的细胞迁移率和增殖能力均高于 Lipo2000/pDNA 处理组。改性 GQDs 具有作为高效基因载体的潜力。它们通过电荷和其他非共价相互作用紧密结合基因分子，大大提高了基因递送的效率，确保基因在细胞内顺利释放。这一创新策略为促进内皮细胞增殖提供了强有力的手段。

研究内容简介

心血管疾病的治疗一直是医学领域的难题，组织工程血管作为潜在解决方案，其长期疗效却受限于内膜增生和血栓形成。基因治疗，特别是针对ZNF580基因的治疗，为快速内皮化提供了新的可能。然而，传统基因载体如PEI等，其转染效率和细胞毒性问题制约了其在心血管疾病治疗中的应用。近年来，量子点作为一种新型基因载体，以其独特的量子效应和稳定性，在基因传递和表达调控方面展现出巨大潜力。量子点不仅能够高效地将ZNF580基因传递至靶细胞，还能显著提高基因的表达水平，从而更有效地促进内皮细胞的增殖与迁移，抑制平滑肌细胞的异常增殖，维护血管稳态。因此，量子点在心血管疾病治疗中具有重要的应用价值，有望为心血管疾病的防治开辟新的道路。

青海民族大学朵兴红副教授课题组针对心血管疾病的治疗需求，创新性地将传统基因载体PEI、生物相容性良好的PLGA和具备独特性质的GQDs通过酰胺化反应结合，制备出了一种新型核壳结构基因载体。这一载体设计巧妙，以PLGA为核，GQDs-PEI为壳，充分发挥了各组分的优势，显著提升了基因传递的效率和安全性。

在制备过程中，课题组首先利用PLGA的生物相容性和可降解性构建载体的核心部分，为基因传递提供了稳定的基础。随后，通过酰胺化反应，将GQDs与PEI紧密结合，形成稳定的GQDs-PEI复合壳层。这一壳层不仅增强了载体的稳定性，还利用GQDs的量子效应和优异生物相容性，提高了基因与载体的结合力，从而有效保护基因免受外界环境的影响。

这种新型核壳结构基因载体在心血管疾病治疗中展现出了独特的优势。它能够高效地将治疗心血管疾病的关键基因，如ZNF580基因，传递至靶细胞。在靶细胞内，载体能够稳定释放基因，并调控其表达，从而促进内皮细胞的增殖与迁移，抑制平滑肌细胞的异常增殖，进而维护血管稳态。这一机制对于心血管疾病的治疗具有重要意义。

与传统的基因载体相比，这种新型核壳结构基因载体还具有更低的细胞毒性和更高的安全性。这得益于PLGA和GQDs的生物相容性，以及通过酰胺化反应实现的精准控制。因此，这种新型基因载体在心血管疾病治疗领域展现出了巨大的潜力，期待未来能进一步突破技术壁垒，为心血管疾病的治疗策略提供新的思路和方向。

一、复合基因载体的理化特性

傅立叶变换红外光谱检测了基因载体的特征官能团（图1A）。结果显示，-OH 伸缩振动在3358cm^-1处，N-H键的伸缩和弯曲振动在 3150cm^-1处，C-N弯曲振动在 1283cm^-1处。傅立叶变换红外光谱分析表明，A-GQDs表面存在-C=O、-OH、-NH和-NH2等官能团。PEI 和 PLGA 接枝后，-CONH 酰胺键在 1700 cm-1 和 1100 cm^-1附近出现特征峰，表明接枝成功。

图1B显示了 A-GQDs 和 C-GQDs-PEI、C-GQDs-PEI-PLGA 和 N-GQDs-PEI-PLGA 载体的平均粒径和平均电位。A-GQDs的平均粒径为5.57±1.42 nm，C-GQDs-PEI、C-GQDs-PEI-PLGA和N-GQDs-PEI-PLGA载体的平均粒径分别为81.83±1.81 nm、96.84±2.61 nm和100.10±1.43 nm。A-GQDs的平均zeta电位为5.04±0.66 mV，而C-GQDs-PEI的zeta电位相对较高（25.06±1.76 mV）。PLGA导致Zeta电位略有下降，即C-GQDs-PEI-PLGA（16.25±1.61 mV）和N-GQDs-PEI-PLGA（20.26±1.31 mV）。带正电荷的载体有利于内吞和转染。

图1C展示了 A-GQDs、C-GQDs-PEI、C-GQDs-PEI-PLGA 和 N-GQDs-PEI-PLGA 的 TEM 图像。可以看出，每个样品的分布都非常均匀，没有大的纳米颗粒或聚集体，形状和大小都很一致。

图1 A-GQDs、C-GQDs-PEI、C-GQDs-PEI-PLGA 和 N-GQDs-PEI-PLGA 的傅立叶变换红外光谱（A）、平均粒径和 zeta 电位分布（B）以及透射电子显微镜图像（C）。

A-GQDs、C-GQDs-PEI、C-GQDs-PEI-PLGA和N-GQDs-PEI-PLGA的稳态荧光光谱由350-390nm的激发光激发（图2）。A-GQDs 具有激发波长依赖性。激发波长为 360 nm 时，A-GQDs 的最大荧光强度在发射波长 460 nm 时达到最大。当激发波长为380nm 时，C-GQDs-PEI的荧光强度在发射波长为480 nm时达到最大。当激发波长为 350 nm时，C-GQDs-PEI的荧光强度在460 nm处达到最大，但N-GQDs-PEI的荧光强度在465 nm 处达到最大。荧光发射峰FWHM较小，峰形对称，表明C-GQDs-PEI、C-GQDs-PEI-PLGA和N-GQDs-PEI-PLGA中的C-GQDs具有较窄的粒度分布。

图2 A-GQDs、C-GQDs-PEI、C-GQDs-PEI-PLGA和N-GQDsPEI-PLGA的 稳态荧光光谱图。

二、复合物纳米粒子的生物学特征

（一）基因载体对 pZNF580 的封装能力和复合纳米粒子的生物相容性

通过琼脂糖凝胶电泳研究了基因载体封装 pZNF580 的能力。如图 3A所示，在电泳条件下，带负电荷的 pZNF580 可以从负极迁移到正极。当 pZNF580 被不同载体压缩时，部分或全部 pZNF580 被阻断。当重量比为 3 时，A-GQDs 可完全负载 pZNF580；当重量比为1时，C-GQDs-PEI和N-GQDs-PEI-PLGA可完全负载 pZNF580；但当重量比为2时，C-GQDs-PEI-PLGA可完全负载pZNF580。因为 PLGA 的引入降低了 C-GQDs 的 zeta 电位。为了更有效地压缩pZNF580，需要更高的 zeta 电位。然而，众所周知，当基因载体表面存在大量正电荷时，通常会表现出相对较高的细胞毒性。考虑到这两方面的因素，在后面的实验中选择了 3 的重量比进行研究。

基因载体和 NPs 在体外的细胞毒性最初通过CCK-8试验进行检测。以Lipo2000和 Lipo2000/pZNF580 为阳性处理组。如图 3B所示，不同基因载体和 NPs 的细胞毒性随载体浓度的增加而增加。在相同浓度下，与Lipo2000和Lipo2000/pZNF580 阳性处理组相比，不同基因载体和 NPs 组的细胞活力相对较高。在相同浓度下，与 A-GQDs相比，含PEI复合物组的细胞活性较低，这是由于PEI中含有大量正电荷。不过，PLGA 的引入降低了C-GQDs-PEI和N-GQDs-PEI基因载体的毒性。即使载体浓度较高（40 µg/mL），基因载体和 NPs 的细胞存活率仍超过80%。这些结果表明，这些载体的细胞毒性很低。

为了进一步验证上述结果，还进行了活/死细胞双染色实验，以观察细胞的存活状态。不同的NPs处理HUVECs细胞48h后（图3C），与阴性处理组（pZNF580）相比，所有NPs/pZNF580 HUVECs 都显示出较高的细胞活性，而Lipo2000/pZNF580阳性处理组的存活细胞数明显低于试验组（pZNF580），表明 Lipo2000 具有较高的细胞毒性。

对平均细胞绿色荧光强度值进行统计分析发现（图3D），与 Lipo2000/pZNF580 阳性处理组（71.98±3.53%）相比，A-GQDs/pZNF580（94.38±6.39%）、C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580（98. 65±6.60%）和N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580（90.08±1.60%）处理的HUVEC的平均荧光强度更高，这是因为Lipo2000对细胞的毒性更大，导致细胞大量死亡。此外，C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580 表现出更高的细胞活力。这些结果与 CCK-8 实验的结果相符。

图3 不同重量比 NPs 的琼脂糖凝胶电泳图（A）；CCK-8 法检测不同基因载体和 NPs 48 小时对 HUVECs 的相对细胞活力（B）；(a）A-GQDs/pZNF580 处理组，（a`）A-GQDs 处理组，（b）C-GQDs-PEI/pZNF580 处理组，（b`）C-GQDs-PEI 处理组，（c）C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580 处理组、 (c`) C-GQDs-PEI-PLGA 处理组，(d) N-GQDs-PEI-PLGA /pZNF580 处理组，(d`) N-GQDs-PEI-PLGA 处理组，(e) Lipo2000/pZNF580 阳性处理对照组，(e`) Lipo2000 处理组。活/死细胞双染色法检测不同基因载体和 NPs 处理 48 h 的 HUVECs 的相对细胞活力（C）和经Image J统计的不同复合基因载体和NPs 24h的HUVEC的相对细胞活力（D）。(a)pZNF580，(b)A-GQDs-PEG-CAG/pZNF580，(c)C-GQDs-PEI-PEG-CAG/pZNF580，(d)C-GQDs-PEI-PLGA-PEG-CAG/pZNF580，(e)N-GQDs-PEI-PLGA-PEG-CAG/pZNF580，(f)Lipo2000/pZNF580。(Mean ± SEM，n=3，*P<0.05 VS A， #P<0.05 VS F)

（二）细胞体外转染及ZNF580的表达

为了评估 NPs 的转染效率，使用 pZNF580 作为靶基因转染 HUVEC。用 Lipo 2000/pZNF580 转染的 HUVEC 作为阳性对照，不含载体的 pZNF580 作为阴性对照。如图4A所示，裸 pZNF580 难以转染 HUVEC。相比之下，基因载体的转染能力很强，表明它们能促进 pZNF580 基因成功转染到细胞中并实现表达。此外，N-GQD-PEI-PLGA/pZNF580 NPs 的转染效率略低于 Lipo2000/pZNF580 阳性处理对照。不含 PEI 的 A-GQDs/pDNA 的转染效率相对低于其他复合物，其中 C-GQDs-PEI/pDNA NPs 的转染效率低于 C-GQDs-PEI-PLGA/pDNA NPs。这些结果表明，经 PEI 修饰的 GQDs 可提高其对细胞的转染效率，而引入 PLGA 则可提高转染效率。

进一步的 Western 印迹实验检测了目的基因 ZNF580 的蛋白表达。如图4B所示，NPs 转染组 ZNF580 蛋白表达量明显高于阴性对照组。与 Lipo 2000/pZNF580 阳性处理对照相比，转染 N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580 纳米颗粒的细胞中 ZNF580 蛋白表达量稍高。转染不含 PEI 的 A-GQDs/pDNA 的细胞中 ZNF580 蛋白表达量相对低于其他复合物。C-GQDs-PEI/pDNA 和 C-GQDs-PEI-PLGA/pDNA NPs 转染细胞的 ZNF580 蛋白表达量与 Lipo2000/pZNF580 阳性处理对照接近。这些结果表明，这些 NPs 能显著增强质粒向 HUVECs 的递送，并提高 pZNF580 在 HUVECs 中的表达。

图4 转染不同 NPs 36 h 后的荧光图（A）和转染效率图（B）。转染 NPs 的 HUVECs 细胞中 ZNF580 蛋白表达的 Western 印迹图（C）和用 Image J 软件绘制的蛋白表达效率图（D）（wNPs/wpZNF580=3）。其中，（a）pZNF580 处理组，（b）A-GQDs/pZNF580 处理组，（c）C-GQDs-PEI/pZNF580 处理组，（d）C-GQDs-PEI-PLGA /pZNF580 处理组，（e）N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580 处理组，（f）Lipo2000/pZNF580 阳性处理对照。(Mean ± SEM，n=3，*P<0.05 VS A， #P<0.05 VS F)

（三）体外细胞迁移和增殖

细胞的迁移能力通过划痕试验进行测量，结果如图5所示。用 Lipo 2000/pDNA 处理的细胞为阳性对照，用 pZNF580 处理的细胞为阴性对照。与阴性对照相比，含有 PEI 修饰 GQDs 的 NP 纳米粒子显示出更好的迁移率。C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580（88.35±0.72%）和 N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580（86.83±1.55%）处理组的细胞迁移率相似，与阳性对照 Lipo2000/pDNA（85.18±4.19%）无显著差异。C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580处理组与C-GQDs-PEI/PLGA/pZNF580处理组相比，细胞相容性略高，这表明 PLGA的引入改善了其细胞相容性。这些结果表明，GQDs-阳离子聚合物基因载体/pZNF580 纳米粒子能增强HUVECs的迁移。

利用 EdU 法进一步分析了NPs对HUVECs增殖的影响。结果表明，各组 HUVECs 均发生增殖，且所有 NPs 均能显著促进 HUVECs 的增殖（图5B）。与阳性对照组Lipo 2000/pZNF580（86.05±2.31%）相比，C-GQDs-PEI/pZNF580（80.79±2.57%）组的细胞增殖率略低，C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580（90. 29±2.75 %）组和 N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580 （87.05±2.48%） 组的细胞增殖能力均高于 Lipo2000/pZNF580 阳性对照组。C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580（90. 29±2.75%）和N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580（87.05±2.4%）组的细胞增殖能力均高于Lipo2000/pZNF580阳性处理组（图5D）。因为C-GQDs-PEI/pZNF580的转染效率低于Lipo2000/pZNF580，ZNF580的表达水平也较低。相比之下，C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580组和N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580组的ZNF580 表达水平与Lipo2000/pZNF580组相似，生物相容性更高。此外，PLGA的引入导致了C-GQDs-PEI电荷数的减少，从而增强了细胞相容性，使C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580和N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580保持了较高的转染水平和较好的细胞增殖水平。

图5 不同时间点 HUVECs 细胞的迁移过程（A）和用 Image-J 计算的 24 小时细胞迁移面积的相对百分比（B）。通过 EdU 掺杂实验测定 24h 时 NPs 对 HUVECs 的增殖作用（C），并用 Image-J 统计分析橙色和蓝色荧光的总数（D）。其中，（a）pZNF580 处理组，（b）A-GQDs/pZNF580 处理组，（c）C-GQDs-PEI/pZNF580 处理组，（d）C-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580 处理组，（e）N-GQDs-PEI-PLGA/pZNF580 处理组，（f）Lipo2000/pZNF580 阳性处理组。(Mean ± SEM，n=3，*P<0.05 VS A， #P<0.05 VS F)

该研究成功利用GQDs阳离子聚合物载体将关键基因pZNF580有效递送至HUVECs，显著促进了细胞的增殖与迁移，为心血管疾病的治疗提供了新的可能。实验结果显示，新型基因载体展现出了优异的基因携带能力。其中，N-GQDs-PEI-PLGA载体虽然细胞毒性略高，但其迁移率最显著，转染效率和蛋白表达量接近商业化产品，显示出巨大的开发潜力。值得一提的是，GQDs的优异理化性能和生物相容性为HUVECs提供了理想的粘附环境和生长条件，有助于降低血栓形成风险，提高TEBV的长期通畅性。

这一研究不仅为心血管疾病的治疗提供了新的策略和工具，而且展示了GQDs阳离子聚合物载体在基因治疗领域的广阔应用前景。随着对新型基因载体研究的深入，有望开发出更为高效、安全的治疗方法，为心血管疾病治疗带来新的思路和方法。

论文第一作者为青海民族大学化学化工学院化学专业硕士研究生徐啟蓉和李晨，通讯作者为青海民族大学朵兴红副教授和天津大学冯亚凯教授。

课题组简介

通讯作者

冯亚凯，天津大学化工学院教授，博士生导师。天津市化工学会委员，天津市生物医学工程学会委员。主要研究方向是表面改性、多功能材料和药物/基因递送。2008年入选教育部新世纪优秀人才。先后在Small、ACS Biomaterials Science & Engineering、Journal of Materials Chemistry B、Macromolecular Bioscience等期刊发表论文100余篇。承担国家国际科技合作、国家自然科学基金、教育部新世纪人才支撑计划等项目，申请专利20余项，授权8项。担任Polymers for Advanced Technologies, Journal of Cellular Biotechnology, International Journal of Polymer Science, The Scientific World Journal, Current Advances in Chemistry Research, Cardiovascular regenerative medicine, Research Journal of Chemistry and Environment，Frontiers of Chemical Science and Engineering，纳米技术(NanoTechnology)，Open Journal of Polymer Chemistry，Chinese Journal of Engineering，合成化学研究，中国组织工程研究等期刊编委，“中国科技论文在线”评审专家。获得天津市科技进步二等奖和天津市产学研突出贡献一等奖等荣誉。

朵兴红，青海民族大学副教授、硕士生导师，基础化学实验示范中心主任。主要从事功能材料开发及应用基础研究，研究方向为靶向递送可降解生物材料、高分子材料、高性能阻燃材料开发等。为青海省“高端创新人才千人计划”拔尖人才。科研成果先后在Journal of Materials Chemistry B、Polymers、langmuir、Polymers Advanced Technologies等期刊发表，申请发明专利 6项，授权 2 项。主持承担国家自然科学基金项目，教育部春晖计划合作项目，青海省自然科学基金项目，省级重点实验室开放课题项目。先后荣获小岛奖励金；青海民族大学优秀班主任；作为指导教师带领学生团队参加“互联网+”等全国大学生创新创业大赛；指导化学师范专业学生参加师范生技能大赛获得二等奖1名，三等奖2名；指导学生参加第四届西北赛区大学生化学实验创新设计竞赛校内选拔赛一等奖；指导学生参加微党课大赛获二等奖、指导学生参加第二届“创青春中国青年碳中和创新创业大赛”获校内选拔赛二等奖。

原文信息

Qirong Xu, Chen Li, Xiangyan Meng, Xinghong Duo, Yakai Feng, Polyethylenimine-modified graphene quantum dots promote endothelial cell proliferation, Regenerative Biomaterials, Volume 11, 2024, rbae013, https://doi.org/10.1093/rb/rbae013

原文链接

Polyethylenimine-modified graphene quantum dots promote endothelial cell proliferation | Regenerative Biomaterials | Oxford Academic (oup.com)

https://academic.oup.com/rb/article/doi/10.1093/rb/rbae013/7614097

DOI：https://doi.org/10.1093/rb/rbae013