以身试毒！石墨烯毒性研究再登Nature Nanotechnology：这种石墨烯在健康人体中基本上是无害的

二维（2D）纳米材料是指至少一维小于100nm的扁平非球形纳米物质，并引起了全世界对各种潜在应用的兴趣，包括建筑材料、汽车轮胎、油墨、食品防腐剂、防晒霜以及防腐和润滑产品。石墨烯是单层或几层碳晶格的典型2D纳米材料。其独特的结构、强度、灵活性、透明度和导电性使其具有广泛的应用吸引力。人们还对进一步开发用于生物医学应用的此类材料，包括诊断剂和药物递送剂，产生了浓厚的兴趣。氧化形式的石墨烯，氧化石墨烯（GO），由于其亲水性、化学功能化的高表面积、在生物相关溶液中的合理胶体稳定性以及与血细胞的兼容性，在生物医学环境中显示出了前景。然而，与其他人造纳米材料一样，在广泛使用之前，需要确定GO的安全性和对人体暴露的限制。GO的毒理学数据有限且不一致，这通常是由于材料的许多不同来源之间的差异及其在尺寸和化学性质方面的显著变化，无法就其安全性得出可靠的结论。最近在小鼠中对这些GO纳米片进行的一项重复和长期的肺部暴露研究发现，大（微米范围）的横向尺寸和高剂量会诱导肺部炎症（尽管明显小于长的刚性碳纳米管）和更持久的肉芽肿。较小（纳米范围）的GO纳米片暴露显示出短暂的炎症反应，暴露后迅速消退。

人造纳米材料和空气污染中的小颗粒物之间可以进行比较。颗粒物暴露与身体几乎每个器官的不良健康影响有关，尽管呼吸和心血管影响导致了与颗粒物相关的大量发病率和死亡率。考虑到肺泡中的高沉积、给定质量的高反应表面积以及对全身器官的渗透，超细（纳米尺寸）颗粒物可能会对这些影响做出贡献。虽然不同种类的制造纳米材料具有不同的性质，但超细颗粒物在一些物理化学特征和它们诱导毒理学效应的途径方面存在共性，如炎症和氧化应激。尽管有大量的大规模流行病学数据将空气污染中的颗粒物与不良影响联系起来，但关于人造纳米材料生物作用的人类数据仅限于人类细胞系培养和职业环境中的生物监测，或小群体个人的孤立意外暴露。吸入是非故意肺部接触人造纳米材料的主要途径，但它也代表了用于呼吸系统疾病诊断和药物输送的纳米药物的一种很有前途的给药途径。因此，迫切需要人类数据来评估风险评估并实现这些材料的真正潜力。

受控的人体暴露研究为评估外源性物质的急性生物学效应提供了几个优势。与流行病学研究不同的是，可以以规定的剂量对物质进行隔离测试。现实世界中的混杂因素，如其他环境压力源（如噪音、压力、高温、锻炼或药物），可以在参与者和研究访问中最小化或标准化。该设计可以进行定制，以包括相关的控制暴露，重复的测量设计允许每个参与者成为自己的控制对象。在诊所或实验室设施中使用受控暴露环境可以扩大终点范围，包括更大范围的亚临床和机制终点，并已成功用于确定燃烧衍生纳米颗粒（如柴油废气排放中的纳米颗粒）的呼吸和心血管影响。然而，只有少数研究测试了人造纳米材料的作用，没有对石墨烯等非球形材料进行研究。

鉴于此，爱丁堡大学Mark R. Miller、曼彻斯特大学Kostas Kostarelos等人旨在了解GO对健康产生有害影响的可能性，主要是从意外暴露的角度来看（例如，在现实世界中越来越多地使用纳米材料的职业或公众暴露）而且从开发用于预期的人类吸入暴露的安全形式的GO的角度来看（例如用于肺的诊断成像或向肺或经由肺递送药物）。使用随机对照双盲交叉设计，研究人员研究了人类志愿者急性吸入GO纳米片的心肺效应。

GO纳米片的合成与表征

研究人员采用改进的Hummers方法合成了薄的、高纯度的无金属和无内毒素GO材料，并对其进行了全面表征。GO纳米片具有严格限定的尺寸，没有金属或其他元素污染、残留物或细菌污染的迹象。选择两个横向维度（保持所有其他物理化学特征几乎相同）进行研究：小GO（s-GO）和超小GO（us-GO）。

参与者通过呼吸面罩吸入气溶胶化的GO纳米片，目标质量浓度为200 μg/m³。在2小时的暴露期间，s-GO和us-GO的实际浓度分别为214±23 μg/m³和224±17μg/m³，并且保持在恒定水平。预期地，相同质量下，us-GO的粒子数比s-GO更多。

图|GO纳米片尺寸分布

吸入GO的临床疗效

本研究遵循了《赫尔辛基宣言》，并在爱丁堡大学以及相关的英国国家卫生服务研究与发展办公室进行了严格的伦理审查。志愿者在精心控制的条件下，通过间歇性骑行吸入GO或过滤空气2小时。在14名参与者中，有13人完成了所有3次访问。所有暴露都得到了良好的耐受性，参与者报告称没有与暴露相关的症状，仅有轻度短暂疲劳与锻炼有关。在每个研究日内均未报告任何症状，整个研究期间也未出现任何临床不良事件。高纯度GO急性吸入没有明显影响的结果突显了在人体中进行石墨烯基纳米材料的控制性暴露用于风险评估的可行性。

图|研究设计和研究计划

肺功能

肺功能测试未显示出急性GO暴露后的直接影响。尽管动物研究未发现GO对气道反应的影响，但可引起肺部炎症。肺部炎症生物标志物或许能加强未来纳米材料暴露研究。小鼠实验表明，GO暴露会导致轻度和短暂的肺部炎症。较大尺寸的GO可能会加剧炎症，或在哮喘等易感个体中产生影响。

系统血液动力学效应

心率和血压测量未显示出GO暴露对其的影响。研究发现，经高剂量静脉暴露后，葡聚糖包被的石墨烯纳米片对小鼠血压没有影响。尽管许多纳米材料具有氧化性质，但本研究未观察到GO对血压的影响，也未在初步脂质组学分析中发现血浆异前列腺素的实质性变化。因此，GO暴露未诱导全身氧化应激。这得到了使用培养的血管内皮细胞进行的研究的支持，这些研究表明，虽然GO被细胞内吞，但并未产生细胞内超氧化物。尽管如此，未来的人体研究中有必要进一步探索这些机制，尤其是评估具有不同氧化还原性质的新型石墨烯材料的风险。

图|暴露于空气、s-GO和us-GO的肺功能和心血管生命体征

血液凝固性

研究人员从血液凝血的角度探讨了环境污染对心血管事件风险的可能影响。研究表明，大气污染颗粒物与血液凝血标志物的升高相关，但数据不一致。本研究观察到暴露后血小板计数和活化部分凝血时间在各组之间相似，而原凝血酶时间在us-GO组暴露后略有增加，但仍在正常范围内。然而，各组之间这些参数并无显著差异。血浆中的纤维蛋白原没有在不同暴露条件下发生变化。

研究引入了动脉血栓形成的体外模型，考虑了血液与血管壁的相互作用。在低剪切力室中，吸入s-GO或us-GO均导致血液的较大血栓形成能力，而在高剪切力室中，仅s-GO暴露组表现出这种效应。这表明传统的凝血标志物是对血栓形成能力的粗略指标，应考虑受损血管壁等生理条件。尽管暴露后血液的血栓形成能力较之前略有增加，但这种影响的程度相对较轻，即使是已有心脏病的患者，后果也可能有限。因此，建议在开发对石墨烯材料进行风险评估的实验模型中包括血栓形成潜能的表征，尤其是对可能存在较高风险的石墨烯材料，或考虑更高的暴露情景。

图|血液凝固性参数

全身炎症

研究人员研究了大气污染颗粒和碳制纳米材料对心血管效应的影响机制。暴露期间白细胞计数增加，但各组影响相同。与小鼠研究结果相似，GO对白细胞计数无影响。炎症因子浓度和急性期反应蛋白CRP在不同暴露间无明显变化。暴露期间的体育锻炼增加了全身循环中白细胞的动员。受控柴油排放暴露可能增加全身炎症标志物，而暴露于碳黑颗粒未引起反应。GO对炎症和急性期反应标志物无明显影响，这可能反映了GO的高纯度。直接比较高纯度材料和商业来源的GO将有助于更好地了解其影响。

图|白细胞计数和炎症标志物

血液蛋白质组学和脂质组学图谱

研究人员利用高保真度血液蛋白质组学进行研究的方法。通过采用先前开发的血浆富集方法和液相色谱串联质谱分析，最大程度地减少了高丰度血浆蛋白的遮蔽效应，并增加了检测到的数据的动态范围。血浆样品通过脂质基纳米颗粒吸附蛋白质，形成可以从未结合蛋白质中回收和纯化的蛋白质晶核。基于研究的时间安排，选择了基线（t = 0 h）和协议结束时（t = 6 h）的血浆进行分析。s-GO暴露志愿者的血浆中共鉴定出692个蛋白质，只有3个与基线（t = 0 h）相比呈差异丰度。us-GO暴露组鉴定了772个蛋白质，仅有4个蛋白质受到影响。蛋白质组学分析发现，SORCIN蛋白在s-GO和us-GO暴露后上调。不同暴露组之间发现了10个和7个差异丰度的蛋白质。因子XII是唯一与颗粒物心肺参数直接相关的蛋白质。总体而言，GO暴露对心肺参数和炎症介质的影响较小。

局限性

虽然在人类参与者中使用受控暴露有很多优点，但该研究依然是有几个局限性。首先，这项基础研究的参与者人数只能根据之前对柴油废气纳米颗粒的研究来检测生物参数的变化。然而，参与者人数可能不足以检测吸入GO的更微妙影响。其次，该研究只能测试一剂GO。出于安全考虑，谨慎选择剂量以避免明显的生理影响，高浓度或更长时间的GO暴露可能会产生当前研究中不明显的作用。然而，研究人员注意到，之前接触过的柴油废气使用了相似的浓度（100-300 μg m⁻³），并伴有使用类似参数测量的心血管功能障碍。最后，人类控制暴露研究仅限于探索急性暴露和有限的测量期。研究方案不能扩展到6h以上，因此，无法捕捉到慢发反应，如一些炎症途径。

小结：

总而言之，研究人员发现，两种横向尺寸为纳米的GO片（s-GO和us-GO），微小厚度（1-2 nm）和高纯度（就金属和内毒素污染物而言）在测试的剂量和持续时间下在健康志愿者中基本上是无害的。这种GO物质既与呼吸或心血管功能的急性变化无关，也与全身炎症无关。虽然对血液凝固性没有重大影响，但在血管损伤的离体模型中，血栓形成性略有增加，这突出表明需要对心血管参数进行全面而微妙的分析，以全面评估吸入的人造纳米材料的作用。这项研究为随后在大量个体中调查GO的人类研究奠定了基础，这些研究可能包括GO氧化程度（和表面氧含量）、纯度和剂量的差异，以及其他健康参数，时间点和潜在易感人群的探索，如哮喘患者和凝血风险较大的人群。应特别注意避免从这些结果中得出结论，因为GO材料的结构和表面特征及其纯度，加上广泛的临床前调查和知识，可以安全和合乎道德地转化为在此进行的人类暴露。这些研究可能是石墨烯和二维纳米材料全面风险评估的重大进展，以采用安全的设计方法来利用这种独特材料的真正潜力。

参考文献：

Andrews, J.P.M., Joshi, S.S., Tzolos, E. et al. First-in-human controlled inhalation of thin graphene oxide nanosheets to study acute cardiorespiratory responses. Nat. Nanotechnol. (2024).

https://doi.org/10.1038/s41565-023-01572-3