【CCL文章推荐】西南大学甄淑君团队：八爪鱼状的DNA纳米结构结合氧化石墨烯增强乙肝病毒DNA检测的荧光各向异性

近期西南大学甄淑君团队在Chin Chem Lett上发表文章，题目Octopus-like DNA nanostructure coupled with graphene oxide enhanced fluorescence anisotropy for hepatitis B virus DNA detection， doi：10.1016/j.cclet.2023.109137.

【工作亮点】

（1）构建了一种基于八爪鱼状的DNA纳米结构(ODN)和氧化石墨烯（GO）共同增强荧光各向异性的新策略。

（2）利用ODN的刚性结构来间隔染料和GO的距离，避免GO猝灭荧光，提高了检测的准确性。此外，由于ODN的体积大，靶物竞争的空间位阻降低，提高了反应的灵敏度。

（3）同时ODN利用六个poly-A₂₀牢牢吸附在GO上，提高了该方法在复杂样品检测中的抗干扰能力。

【背景介绍】

荧光各向异性（FA）是一种基于分子旋转的生物传感方法。它是一种比率测量法，反映了荧光基团的固有特性，如尺寸、旋转速度和寿命。与其他荧光分析方法相比，荧光各向异性法对强度波动和光漂白的敏感性较低，已广泛应用于蛋白质、金属离子、小分子、核酸分子等多种靶标的检测，同时它也被用于探究物质之间的相互作用。然而，大多数方法受到目标分子质量小的限制，导致检测灵敏度有限。因此，选择合适的FA增强材料，构建具有较高灵敏度的FA检测方法是十分有意义的。

在此工作中，作者建立了一种新型的FA放大策略。该策略以DNA四面体为骨架，将其设计为八爪鱼形状的DNA纳米结构（ODN），并结合氧化石墨烯（GO）同时增强ssDNA的荧光各向异性值(r)，用于灵敏检测乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）。

【图文解析】

如图1所示，作者用4条DNA单链S1、S2、S3和S4自组装形成ODN。同时，S1的部分序列被设计为捕获DNA (cDNA)，能与探针DNA（pDNA）杂交，其余的DNA通过p-p堆积作用使ODN吸附在GO上。在没有HBV-DNA时，羧基四甲基罗丹明（TAMRA）修饰的pDNA与cDNA通过碱基互补配对杂交。同时，ODN通过6个poly-A₂₀与GO结合，形成ODN-GO复合物。因此，TAMRA的旋转受到较大质量的GO和ODN的同时限制，得到较高的r值。加入HBV-DNA后，HBV-DNA通过立足点介导的链交换反应与pDNA杂交形成双链(dsDNA)结构，离开ODN和GO表面。此时，由于dsDNA的质量较小，在溶液中旋转速度快，TAMRA的FA值较低。因此，通过显著降低的FA值可实现HBV-DNA的灵敏检测。

图1. ODN-GO增强FA对HBV-DNA检测的原理图

首先，用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）证实了ODN的形成。此外，利用原子力显微镜对GO和ODN-GO进行了表征，证实了ODN-GO的成功构建。

图2. (a-c) ODN， (d-f) GO和 (g-i) ODN-GO的表征。(b, c)12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳图;M是Marker。(e, h)原子力显微镜表征。(f, i)原子力显微镜图像的高度分布。

接着作者验证了该方法的可行性，证实了只能当GO和ODN同时存在时，Δr/r₀最大。ODN-GO增强的Δr/r₀值比单独使用ssDNA约高2.5倍，比单独使用GO约高2倍。作者也证实ODN具有较强的刚性结构和较高的增强FA的能力。

图3.体系的可行性分析。(a) HBV-DNA与GO或ODN反应前后r (Δr/r₀)的变化。(b) ODN-GO和dsDNA-GO增强FA的示意图。(c)dsDNA-GO和ODN-GO对荧光染料TAMRA的影响的荧光光谱图。(d) dsDNA-GO和ODN-GO对体系荧光各向异性增强的比较柱状图。浓度： ODN, 50 nM; pDNA, 50 nM; GO, 14.0 μg mL^-1; HBV-DNA, 40 nM

最后，在最佳的实验条件下，Δr/r₀与HBV-DNA在1 nM-50 nM浓度范围内呈良好的线性关系。线性回归方程为Δr/r₀ = 0.008c + 0.033（R² = 0.99），其中c为HBV-DNA浓度（单位为nmol/L）。检测限（LOD）为330 pM (3σ/k)。相较于只有GO增强和只有ODN增强的FA策略，作者提出的方法具有更高的灵敏度。

图4. 不同FA增强策略的灵敏度比较。(a) ODN和GO增强FA的示意图。(b) Δr/r₀与HBV-DNA浓度在ODN和GO双重增强作用下的线性关系。(c) ODN增强FA的示意图。(d) Δr/r₀与HBV-DNA浓度用ODN增强FA的线性关系。(e) GO增强FA的示意图。(f) Δr/r₀与HBV-DNA浓度在GO增强FA的的线性关系。浓度： ODN, 50 nM; pDNA, 50 nM; HBV-DNA, 40 nM, GO, 14.0 μg/mL。