意大利理工学院Fabio Benfenati–氧化石墨烯和少层石墨烯与血脑屏障的相互作用

由于石墨烯基材料（GRMs）的生物相容性和高运载能力，它可能代表了一种理想的大脑输送系统。石墨烯基材料到达大脑的能力主要是在体内进行的调查，并突出了一些争议。在此，我们采用了两种复杂性不断增加的体外BBB模型来研究与氧化石墨烯（GO）和几层石墨烯（FLG）的仿生相互作用：二维小鼠Transwell模型，然后是三维人类多细胞集合体，以模仿体内结构的复杂性和细胞间的串扰。我们开发了特定的方法来评估GO和FLG在无标签方式下的转移，以及一个适用于任何纳米材料的平台。总的来说，我们的结果显示这两种GRM具有良好的生物相容性，不影响屏障的完整性和功能。充分分散的GO和FLG亚群被内皮细胞积极吸收；然而，这种转移被认为是一种罕见的事件。

图1. 接触GRM后BBB特性的描述。暴露于10μg/mL的GO（A）或FLG（B）48小时后，在玻璃盖玻片上播种的bEnd.3单层细胞中，ZO-1（绿色）的免疫荧光染色的代表性共聚焦图像。Hoechst染料用于核子的可视化（蓝色）。GRM颗粒在光反射模式（LR）模式下是可见的（粉红色）。BF表示亮场图像。比例尺。50μm。(C）暴露于10μg/mL的GO和FLG 6、24和48小时后的TEER值。对于每个时间点，其值都被归一化，并以平均值±SD表示（n=9个独立的制备）。(D）暴露于10μg/mL的GO和FLG 6和48小时后，FD4的表观渗透性（Papp，%）。没有细胞的Transwell（空）的Papp表示为100%，数值相应地被归一化。数值表示为平均值±SEM（n = 3）。

图2. GO和FLG的摄取动力学和内化途径。代表性的TEM显微照片显示GO（A）和FLG（B）薄片在bEnd.3细胞中的细胞内化。在左边的低倍显微镜照片中，N表示细胞核。(C) GO和FLG(10 μg/mL)在bEnd.3细胞单层中暴露于这些材料2、6、24和48小时的吸收动力学。数据表示为平均值±SEM（n = 3个独立制备）。*p < 0.05, ***p < 0.001, 非配对学生t检验。在没有或存在不同的内吞作用抑制剂（CPZ、CYTD、NOC）的情况下，暴露2小时后细胞对GO（D）和FLG（E）（10 μg/mL）的吸收。平均数±SEM，n = 3。** p < 0.01, ***p < 0.001, 单向方差分析/Tukey检验。所有摄取量的测量是由SSC在流式细胞仪中完成的，并在未处理的细胞（CTRL）上进行归一化处理。

图3. GO和FLG在bEnd.3细胞单层上的转位。(A) 两种GRM片穿过二维BBB模型的过程示意图。(B）用10μg/mL的GO或FLG培养24小时的bEnd.3细胞的代表性共聚焦XY平面和Z投影。细胞用Hoechst（细胞核，蓝色）和ZO-1抗体（绿色）进行染色。比例尺。50μm。(C）去除细胞后的Transwell膜（BF）的代表Z投影图。一些GO和FLG的片状物在膜上易位，可见粉红色（LR模式）。比例尺：20μm。(D）基底层馏分的分析：基底层馏分中发现的石墨烯团块的代表性拉曼光谱和相应的样品区（插图中的BF图像）。

图4. 与线性弯曲、Hencky解和FvK模型相比，GPH膜相对于径向位置的偏转。（a） 254 nm的膜厚加压至ΔP=21 kPa。（b） 夹紧膜边缘周围（a）的放大。（c） 65 nm的厚度加压至ΔP=68 kPa。（d） 夹紧膜边缘周围（b）的放大。（e） 加压至ΔP=116 kPa的45 nm厚度。（f） 夹紧膜边缘周围（e）的放大。

图5. GO和FLG与BBB的三维人类多细胞集合体模型的相互作用：流式细胞仪和TEM分析。(A) 预染hMCA形成和解离的工作流程示意图。(B) NHA、hBPV和hCMEC/D3的三个独立培养物在流式细胞仪上一起运行时，SSC与FSC（前向散射）的点图和细胞追踪器红色（星形胶质细胞）和绿色（周细胞）的门控。(C) 解离的hMCA的SSC与FSC和细胞追踪器红色（星形胶质细胞）和绿色（周细胞）的点阵图。(D) 在流式细胞仪上独立运行的三种细胞类型（NHA、hBPV和hCMEC/D3）的平均SSC定量。(E) 三个细胞型（NHA、hBPV和hCMEC/D3）在hMCA解离后的平均SSC定量。数据表示为平均值±SEM（n = 2）。(F) 不同细胞型对GO和FLG的吸收，以SSC的倍数比对照细胞增加表示。数据表示为平均值±SEM（n = 3）。暴露于GO（G）和FLG（H）的hMCA的TEM显微照片，显示了周边细胞层的罕见材料内化。

相关研究成果由意大利理工学院Valentina Castagnola和Fabio Benfenati  等人2023年发表在Nano Letters (https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c00377)上。原文：Interactions of Graphene Oxide and Few-Layer Graphene with the Blood–Brain Barrier。