Adv. Mater.: 植入石墨烯量子点用于靶向增强肿瘤成像和局部药代动力学长期可化视

背景介绍

石墨烯量子点(GQDs)是一类新兴的光致发光碳纳米材料，具有亚10nm的特征尺寸，其具有超高的光稳定性，明亮的荧光，低细胞毒性，良好的长期生物安全性和易于清除性。同时，蛋白质大小的GQDs(几十kDa)比其他准球形的碳点(CDs)(数百kDa)更适合生物靶向和分子成像。近年来，GQDs在体内生物医学应用潜力方面已被成功探索，如磁共振成像(MRI)、独特的治疗平台和一些初步的荧光成像。然而，对于目前的荧光GQDs，在体内靶向和多模态分子生物成像仍然面临挑战，关键的荧光应用还无法实现。

几个主要障碍被认为显着限制了GQDs广泛的体内生物成像应用。首先，纯GQDs通常表现出较短的血液循环半衰期和肿瘤积累不足，这主要影响了GQDs在体内的有效性其次，常规的GQDs表面工程，如隐性到黏性转变和结合配体的靶向功能化等，会影响GQDs的光物理性质，甚至会显著猝灭光致发光。第三，后合成工程的限制将进一步阻碍GQDs与其他纳米药物复合，实现精确诊断中尤其需要的多模态分子成像。在各种促进血液循环和肿瘤积累的方法中，表面聚乙二醇(PEG)嫁接是纳米颗粒(NPs)最典型和最有效的策略之一，可以显著降低免疫系统对NPs的不良清除。此外，治疗性大分子或蛋白质通常可以穿透中等密度的PEG层并在空隙中负载。

在此，清华大学和中科院自动化所等单位的研究人员展示了在典型的PEG化NPs中原位植入GQDs形成多功能靶向纳米探针(NPC-GQDs-PEG)的策略，然后有效地应用于体内生物成像。小分子芘(C16H10)作为石墨烯晶格的原始“细胞”，大部分穿透PEG层，并在PEG空隙中逐渐组装和生长。植入的GQDs自然继承了NPs聚乙二醇化的优点，与典型的GQDs相比，其血液循环半衰期提高了4倍，肿瘤积累增强了7-8倍。由于易于靶向功能化PEG层，植入的GQDs可以特异性标记各种癌细胞系(乳腺癌、肝癌、胰腺癌)中的不同靶点(细胞表面受体、细胞骨架成分)。

由于NPs核心的多功能性，NPC-GQDs-PEG可以同时实现多模态MRI和光声成像(PAI)，以及荧光成像引导的肿瘤手术。此外，作者还探索了在体内长期、实时监测GQDs种植的NPs，并实现了NPs在肿瘤微环境和器官中局部药代动力学(吸收、分布、代谢和排泄)的可视化。在PEG修饰的NPs中植入GQDs，使其体内生物成像更加可行，为GQDs的体内应用提供了一种新的策略。

文章以“Planted Graphene Quantum Dots for Targeted, Enhanced Tumor Imaging and Long-term Visualization of Local Pharmacokinetics”为题发表在 Advanced Materials 上。

图文导览

从石墨烯种子分子芘被原位植入聚乙二醇化纳米颗粒中，形成NPC-GQDs-PEG。首先，采用原位氧化聚合方法合成了磁共轭聚吡咯聚合物(Fe3O4@PPy)纳米颗粒核(NPC)。NPC直径约40~45 nm，聚合物外壳约2~3 nm(图1b)。然后，长链(10 KDa)胺-PEG与聚合物层的羧基反应形成PEG接枝层。然后加入芘(C16H10)的衍生物1,3,6-三硝基芘分子，在氨和水合肼溶液的混合物中，通过水热缩合反应，穿透PEG层空隙，原位形成GQDs(图1a)。

图1. NPC-GQDs-PEG纳米颗粒的制备与表征。

作者首先测量了静脉注射的NPC-GQDs-PEG/2-DG和两种表面功能化的GQDs (GQDs-OH和GQDs-NH₂)的血液清除率。与纯GQDs相比，NPC-GQDs-PEG的分布更慢，清除时间更晚(图2a,b,c)。具体而言，两种GQDs的分布半衰期(t_α,1/2)约为0.4 h, NPC-GQDs-PEG约为1.46 h，消除半衰期(t_β,1/2)约为4h, NPC-GQDs-PEG约为17 h (17.20±5.16 h)。此外，GQDs的浓度-时间(AUC)曲线下面积约为170~180 ID% h g^-1(图2d)，而NPC-GQDs-PEG的AUC在注射36h后(AUC_0-36h)超过430 ID% h g^-1。从PEG修饰的NPs中植入的GQDs在体内比单独的GQDs在血液循环中更持久。

广泛的文献表明，更长时间的血液循环可以通过增强的肿瘤EPR效应。作者进一步研究了NPC-GQDs-PEG/2-DG和GQDs在肿瘤时间的浓度分布(图2e,f,g)。NPC-GQDs-PEG的肿瘤(AUC_tumor)曲线下面积为877.7 ID% h g^-1，而GQDs (-OH)和GQDs (-NH2)的肿瘤曲线下面积分别为118.6 ID% h g^-1和115.9 ID% h g^-1。在异种移植乳腺癌模型中，NPC-GQDs-PEG的肿瘤递送效率为3.12%，约为纯GQDs的7.5倍(GQDs-OH为0.42%，GQDs-NH₂为0.41%)。进一步对主要器官定量生物分布分析表明，NPC-GQDs-PEG在肝脏和脾脏中趋于逐渐富集，部分原因是由于其血液循环半衰期较长，而纯GQDs由于体积极小，可通过尿液快速排出。

图2. NPC-GQDs-PEG的体内血液清除和生物分布。

作者进一步探索了NPC-GQDs-PEG在亚细胞水平特异性有效标记分子目标的潜力。使用典型的EDC/NHS化学方法，最外层PEG的末端可以很容易地与小分子、多肽和蛋白质缀合(图3a)。由于葡萄糖消耗增加，2-脱氧葡萄糖(2-DG)分子可以显著增加某些癌细胞的NPs内吞。NPC-GQDs-PEG/2-DG探针在孵育4小时后被MCF-7乳腺癌细胞大量摄取(图3b)。然后，用与Glypican-3*结合肽GP2633偶联的NPC-GQDs-PEG检测Glypican-3。NPC-GQDs-peptide成功地在人HepG2肝癌细胞表面标记了GPC-3(图3b)。同样，与RGD肽结合的NPC-GQDs-PEG，特异性靶向plectin-1细胞膜标志物，也能有效结合到plectin-1阳性和人PANC-1胰腺癌细胞表面(图3b)。然后，作者尝试用phalloidin**偶联的NPC-GQDs-PEG对人SK-BR-3乳腺癌细胞内的F-actin进行染色。SK-BR-3细胞的细胞骨架F-actin被NPC-GQDs-phalloidin清晰地标记(图3c)。这些结果表明，基于NPC-GQDs-PEG的探针能够特异性地标记不同类型癌细胞的不同类型靶点 (图3b)。

图3 a，基于不同需求的NPC-GQDs-PEG靶向功能化示意图。目标分子、多肽或抗体可以偶联在PEG外层。b，功能化的NPC-GQDs-PEG靶向表面或细胞内癌症标记物:针对MCF-7细胞的NPC-GQDs-PEG/2-DG，针对HepG2细胞的NPC-GQDs-PEG/肽，针对PANC-1细胞的NPC-GQDs-PEG/RGD。细胞骨架用罗丹明B(红色)-phalloidin染色，细胞核(蓝色)用4′，6-二氨基苯基吲哚(DAPI)染色。c, NPC-GQDs-phalloidin靶向SK-BR-3细胞骨架(绿色)。*Glypican-3，（GPC-3），一种在某些肝细胞癌(HCC)细胞表面过表达的癌症标记物。**phalloidin是一种用于染色肌动蛋白丝的高选择性双环肽。

对于大多数癌症手术治疗，磁共振成像(MRI)和光声成像(PAI)等成像方法可以提供准确的诊断信息，荧光分子成像(FMI)可以在术中确定病变与正常组织之间的边界。而有针对性的多功能探针是实现这些目标的关键。将NPC-GQDs-PEG/2-DG探针静脉注射到患有MCF-7肿瘤的BALB/c小鼠体内。MRI信号显示了NPC-GQDs-PEG在全身的动态生物分布和肿瘤的精确位置(图3d和图S12)。PA成像信号(图3e和图S13)显示注射后24 h探针在整个肿瘤内大量聚集和广泛分布，而周围组织信号非常微弱。

图3. d, MCF-7荷瘤小鼠在静脉注射后不同时间的代表性T2-MR图像，包括仰卧位和横切面图像。e，静脉注射前和注射后24 h肿瘤三维(3D)和二维PA图像。亮区为肿瘤血管，富含血红蛋白。绿色信号对应NPC-GQDs-2-DG的分布。S12. MCF-7荷瘤小鼠静脉注射NPC-GQDs-PEG/2-DG后不同时间的代表性伪彩色T2-MR图像，包括仰卧位和横切面图像。S13. 2D体内PA图像，两段来自于静脉注射NPC-GQDs-PEG/2-DG前和24 h后的3D PAI图像。明亮的部分是肿瘤部位的血管，因为有血红蛋白。绿色区域对应NPC-GQDs-PEG/2-DG的分布。注射后24小时，小鼠肿瘤的PAI对比明显增强。

在注射后24小时的最佳代谢点，MRI和PAI都能清楚地显示许多肿瘤内细节和周围信息。基于这一信息，在探针注射24小时后进行FMI引导手术。然而，通过检测探针的荧光信号，在切除床上很容易看到一个小的残余病灶(<0.3 mm)(图S15和图3f上图)。作者移除了覆盖在探针阴性组织周围的小病灶以作进一步的组织学分析。对苏木精和伊红(H&E)染色组织的分析证实，显示荧光的区域包含切除后残留的肿瘤，而探针阴性的区域包含正常组织(图3f下)。因此，NPC-GQDs-PEG/2-DG探针可以准确定义肿瘤边缘，检测残留微肿瘤。此外，FMI引导组(FMI-surgery)小鼠的存活率(每组n=6)明显高于正常手术组(N-surgery)和对照组(图3g)。因此，GQDs的FMI指导可以极大地提高手术效果。

图3. f，荧光成像引导术中检测和去除小鼠MCF-7肿瘤的微肿瘤灶。切除病灶组织切片用苏木精和伊红染色(H&E)，绿色荧光信号来自GQDs。肿瘤和正常组织之间的边界用红色虚线标记。g，不同治疗方式小鼠的生存曲线:无治疗(对照组)、正常手术(N-surgery)、荧光成像引导手术(FMI-surgery)。每组6只小鼠。

基于GQDs优异的光稳定性，作者进一步探索了实时和长期跟踪肿瘤微环境中装载GQDs的NPs，这被认为是评估纳米药物疗效的关键。通过双波段激光激发(480 nm和660 nm)光纤共聚焦荧光显微镜在Balb/c小鼠移植MCF-7肿瘤中监测系统给药NPs的局部药代动力学(图4a)。在肿瘤成像时，将一根光纤应用于表皮下的肿瘤表面(S探针)。然后，另一根光纤(D探针)进一步穿透肿瘤组织深部(图4a)。首先以NPC-AF488-PEG/2-DG为对照，埃文斯蓝(EB)为血管造影剂，评估了NPC-GQDs-PEG/2-DG在肿瘤组织中连续光照10 min下的体内光稳定性。GQDs的荧光信号在连续10分钟的光照下保持稳定，没有明显的衰减，而AF488在光照10分钟后仅保持20%左右(图4b和4c)。EB信号也有较大的衰减，但衰减幅度因血液循环速度不同而不同。

在静脉注射NPC-GQDs-PEG/2-DG (25 mg kg^-1)后3天内，对肿瘤浅部和深部组织进行每一个时间点持续光照10 min的延时成像。提前数小时注射的EB不仅能染色血管，还能穿透深部组织。注射后2小时，在浅表组织的脉管系统中可见较强的GQDs信号，而在深部组织中可见较弱的GQDs信号。注射后2h至24h, NPs逐渐从血管渗出并富集到表面周围组织，更多的NPs同时逐渐渗透到深层组织(图4d和补充视频1-4)。随着时间的进一步延长，NPs逐渐从肿瘤中代谢出来，但NPs在深层组织中的荧光信号下降较慢，这主要是由于脉管系统不完整和组织压力较高所致。定量荧光计算进一步证实了这些结果(图4e)，并表明NPs“离开”肿瘤组织比“进入”肿瘤更慢，特别是对于肿瘤深部组织。

此外，实时和长期跟踪体内嵌入GQDs的NPs可以扩展到其他器官。在腹部开一个小手术口(3~ 4mm宽)，使光纤能够探测腹腔内的器官(图4a)。静脉注射后，NPC-GQDs-PEG/2-DG在肝脏和脾脏逐渐积累(图4f，图S20)，在活体和脾脏分别于24 h和48 h达到最大值(图4g)。NPs从肝脏和脾脏逐渐清除，荧光信号明显降低。有趣的是，在注射后48小时和72小时，NPC-GQDs-PEG从血液中几乎完全清除后，肾脏中的GQDs信号并未消失(图4f和4g)。这些残留的GQDs信号可能来自于NPC-GQDs-PEG在体内随时间逐渐释放的GQDs。因此，植入的GQDs可以在肿瘤微环境和主要器官中长期、实时跟踪系统给药NPs的动态。

图4.  实时、长期监测局部组织中NPC-GQDs-PEG。

总结与展望

从芘分子到纳米颗粒外PEG接枝层原位种植GQDs的方案为GQDs的体内生物成像应用提供了一种新的策略。这种方法可以使GQDs继承PEG化纳米药物的合理设计和理化性质，显著延长血液循环，增强GQDs的肿瘤积累，并在不破坏GQDs独特结构的情况下提供一个通用的、可访问的靶向修饰平台。此外，纳米医学的多功能使得多模态分子成像成为可能，这补充了仅基于GQDs的荧光成像的内在局限性。这为GQDs在体内的广泛深入应用提供了条件。此外，由于其超高的光稳定性和明亮的荧光特性，种植的GQDs提供了一种可持续的生物成像方法，可以长期、实时跟踪和可视化PEG修饰的NPs在肿瘤和器官局部组织中的整个药代动力学过程。有趣的是，种植的GQDs也可以从聚乙二醇化的NPs中逐渐释放，并应从体内清除，保持GQDs良好的长期生物安全性。

阅读和理解许多生命现象和活动通常需要具有高时空分辨率的可持续生物成像，以研究精细亚细胞活动在几分钟到几天的时间尺度上的长期、快速动态。典型的延时生物成像可能会错过短暂但重要的信号。因此，种植在纳米医学中的超高光稳定性荧光GQDs在广泛应用中有很大的潜力来缓解这些不良情况，如胚胎发育、干细胞分化轨迹、和基于成像的时空单细胞组学。当然，目前种植的GQDs纳米粒子也有很多局限性：一是绿色荧光GQDs的穿透深度有限，二是核心NPs在体内短时间内无法生物降解。然而，未来可以通过优化核心纳米药物的选择和近红外GQDs的调控来改善这些问题。因此，这种扬长避短的策略将拓宽GQDs的体内生物成像领域。

文献链接：https://doi.org/10.1002/adma.202210809