石墨烯为基底开发多功能纳米生物催化系统

摘要

鉴于石墨烯具有广阔的表面积和独特的物理化学属性，包括高机械刚度、弹性、强度和卓越的导热性和导电性，石墨烯和基于石墨烯的纳米结构材料在不同领域引起了研究人员极大的兴趣，如能源储存、催化、环境传感和修复。较大的表面积和功能化的适应性使石墨烯基纳米复合材料成为固定各种生物分子、蛋白质和酶的理想纳米载体。石墨烯纳米结构被各种功能基团（即羟基、羧基和环氧化物基团）功能化后，有可能引入新的特性，从而提高固定化生物催化剂的性能，如增强在活体中的运输能力，保护其免受蛋白酶的作用，促进电子转移到蛋白质，以及在微芯片生物反应器和微型设备中有效整合酶。在此，我们介绍了目前在利用石墨烯纳米材料进行酶固定化，为一系列生物技术应用开发强大的纳米生物催化系统方面的进展。在总结了基于石墨烯的纳米材料的工程和酶与材料的协调以提高催化性能之后，我们特别强调石墨烯和基于石墨烯的纳米结构作为理想的支持基质，为多方面的生物技术应用开发多功能纳米生物催化系统的前景。在这个快速发展的领域，我们也概述了可能的挑战和基于未来的观点。

ABSTRACT: Given the extensive surface area and unique physicochemical attributes, including high mechanical stiffness, elasticity, strength, and superior thermal and electrical conductivity, graphene and graphene-based nanostructured materials have enticed supreme researcher’s interest in diverse fields, such as energy storage, catalysis, environmental sensing, and remediation. Substantial surface area and functionalization amenability render graphene-based nanocomposites interesting nanocarriers for immobilizing a variety of biological molecules, proteins, and enzymes. Functionalization of graphene nano-constructs by various functional moieties (i.e., hydroxyl, carboxylic, and epoxide groups) offer the opportunity to introduce novel properties that leads to enhanced performance of immobilized biocatalysts, such as enhanced transportation ability in living entities, protection from proteolytic action, facilitating electron transfer to the protein, and efficient integration of enzymes in microchip bioreactors and microdevices. Herein, we present current developments in exploiting graphene nanomaterials for enzyme immobilization to develop robust nano-biocatalytic systems for a range of biotechnological applications. After summarizing the engineering of graphene-based nanomaterials and enzymenanomaterial coordination for enhanced catalytic performance, particular emphasis has been given to thoroughly illustrating the promise of graphene and graphene-based nanoarchitectures as ideal support matrices to develop multifunctional nano-biocatalytic systems for multifaceted biotechnological applications. Possible challenges and future viewpoints in this quickly evolving field are also directed.

关键词：纳米生物催化作用 石墨烯 磁性氧化石墨烯纳米复合材料 膜反应器 木质纤维素水解 污水处理

01 引言

与游离的酶相比，固定化的衍生物拥有许多不可缺少的优点，包括提高对映选择性、可重复使用、增强操作稳定性、方便反应器操作和产品回收，避免了酶催化剂的浪费[1]。更重要的是，固定化过程可通过操纵催化中心的几何构型来提高酶的选择性，从而增加酶构象和酶的微环境的稳定性[2]。但是固定化的生物催化剂也可能表现出比游离酶更低的催化活性，因为酶的活性位点有部分阻塞，底物和酶分子之间的质量转移限制增加，以及构象的改变，这对其生物催化活性是不利的[3]。因此，探索新的支持材料和酶固定化的协议是至关重要的。

基于石墨烯的纳米复合材料具有较大的表面积，使其成为固定各种酶和生物分子的卓越支持基体。石墨烯及其衍生材料可以被各种功能基团（即羟基、羧基和环氧化物基团）功能化，以开发具有扩展特性的工程纳米材料，作为纳米组件和纳米支架应用[4]。

02 合成石墨烯基纳米材料

利用三种不同的方法可以合成基于石墨烯的光催化纳米复合材料。

第一种方法需要利用氧化石墨烯GO中拥有氧气的位置作为纳米粒子形成的起始点，直接在GO的表面形成纳米粒子。例如，将TiF₄在60^◦C的GO水溶液中水解24小时，形成TiO₂-GO纳米复合材料[5]。

第二种方法将GO改变为还原氧化石墨烯（rGO），以使电子更容易移动。例如，氧化锌-石墨烯的复合材料是通过将GO的分散体引入到盐（Zn(AcO)₃H₂O）中作为先导材料制成的[6]。

第三种方法使用单步直链氧化还原过程来制备石墨烯光催化复合材料[7]。

03 GO表面功能化

3.1 PEG功能化

使用聚乙二醇（PEG）可以改善石墨烯复合材料的溶解率和生物相容性。如利用以胺为末端的分支PEG，逐步将GO PEG化。超声波烧蚀用来将较大的石墨烯氧化物分解成更小的纳米石墨烯氧化物（nGOs），然后利用 EDC/NHS 化学方法，将 nGO 的羧酸单元与分支PEG共价键接。使用PEG化方法进行功能化，于体外表现出较低的毒性作用[8]，而具有末端胺基的PEG的GO还可以为后续的生物结合提供大量的氨基位点。

3.2亲水聚合物功能化

如聚丙烯酸(PAA)[9]、聚赖氨酸(PLL)[10]、壳聚糖[11]和葡聚糖[12]。在其中一项研究中，PLL被用来对GO进行功能化处理，这通过PLL和氢氧化钾（KOH）搅拌的GO溶液来完成，随后用硼氢化钠（NaBH₄）处理GO[13]。在合成的PLL功能化GO中存在大量的氨基，这表明它具有生物相容性和高度的可溶性。在一个不同的研究项目中，通过超声波和微波照射产生了PAA包覆的GO[14]。除了提高GO的生物相容性外，PAA的功能化还可以作为连接甲基丙烯酸荧光素的桥梁，从而使荧光GO用于成像系统。

3.3 非共价功能化

除了共价键之外，GO表面的其他改变是非共价处理，如π-π填料、疏水作用和静电力也可能增加石墨烯衍生物的生物相容性和可溶性。如使用PEG接枝的聚（马来酸酐-1-十八碳烯）（即C₁₈PMHPEG），通过石墨烯表面和C₁₈PMHPEG聚合物中的长度烷基端基之间强大的疏水耦合，对纳米RGO（nRGO）的表面进行了改性[15]。

04 协调酶-纳米材料以提高催化性能

基于石墨烯的纳米材料与生物大分子相互作用是至关重要的，因为它们决定了酶附着在固定化运输器上的强度，以及这对酶的催化功能的影响程度[16]。范德瓦尔斯相互作用、静电作用、p-p配对或疏水相互作用是基于石墨烯的纳米材料与生物分子连接的主要方式。

在酶和纳米材料之间的相互作用中，静电作用是很重要的，特别是当涉及到负电荷的GO时[17]。将细胞色素c（Cyt c）固定在GO衍生物上是这些方法的一个例子[18]。当带正电荷的细胞色素c被加载到带负电荷的纳米材料上时，加载效果达到了可能的最高水平[19]。

最常用的固定化方法侧重于蛋白质和纳米材料之间的相互作用，涉及通过物理吸附的非特异性结合[20]。由于吸附很容易，而且不受化学结合酶的影响，所以它经常被用作固定化方法。然而，蛋白质会从纳米材料的表面漏出，这是非共价固定化的主要缺点。

基于共价键的固定化可以缓解前面的问题，在大多数情况下，由于增强了稳健性，稳定性得到了提高。最常采用的策略是应用适当的交联剂。对于GO上的羧基，可以使用碳二亚胺，如1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）[21]。胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶以及BSA的固定化都是用这种方法成功完成的。

戊二醛是一种常见的交联剂，用于基于石墨烯的有胺基的纳米材料。Manjunatha等人用BSA对石墨烯表面进行功能化处理，使用戊二醛对游离胺与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶交联[22]。

05 石墨烯固定化纳米生物催化系统的应用

5.1. 从水中去除染料

酶辅助处理受污染的水，主要使用氧化还原酶，然而，直接使用酶去除染料也存在低稳定性和不可重复使用的问题。近十年来，研究人员报道了石墨烯基酶生物结合物在处理染料污染水方面的应用。通过静电作用，将HRP固定在GO上，用于去除水中的各种酚类化合物，尤其是对2-氯苯酚和2,4-二甲氧基苯酚[23]开发了一种加载了laccase的GO-聚醚砜（GO-PES）膜，用于降解和分离水溶液中的合成染料。与不含漆酶的GO-PES膜相比，加入酶的膜在水晶紫、甲基橙、活性亮蓝和活性亮蓝的生物催化降解方面表现出极大的改善。

5.2. 酮的不对称还原（不对称合成）

酒精脱氢酶（ADH）已被广泛用于酮类的不对称还原。为了提高可回收性，Kamogawa, Issasi, Sasaki, & Matsuda [24]通过物理吸附将ADH固定在GO和rGO上，开发了GO-GcAPRD和rGO-GcAPRD纳米复合材料。所制备的rGO-GcAPRD有效地催化了各种酮类物质还原成各自的(S)-醇，并具有高产率和出色的对映选择性。他们还生产了(S)-1-(3′,4′-二氯苯基)乙醇(一种药物中间体)，其效率超过99%，分离率为80%。

5.3. 木质纤维素生物质水解

生产第二代乙醇的一个关键步骤是使用木聚糖酶和纤维素酶，将木质纤维素材料水解成可发酵的糖类。在一项研究中，[25]使用GO纳米片作为物理交联剂，制造了CMC接枝的2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸共聚物水凝胶的新型三维网络。将一种模型酶（PersiCel1）固定在GO增强的双交联水凝胶网络上，使其在90◦C的高温下保持了约60％的原始活性，同时在储存稳定性和特定的生物活性方面有了明显的改善。与游离酶相比，固定化的PersiCel1在碱处理甜菜浆的生物转化中增加了154.8%，而PersiCel1/neat-水凝胶生物共轭物在类似条件下增加了66.7%。

06 结束语和未来展望

基于石墨烯的纳米结构材料由于具有一系列迷人的结构属性，理想的电气、化学和机械性能，以及对有效装载酶和大分子的功能化的适应性，已经获得了研究人员越来越多的兴趣。

尽管在这一领域已经取得了广泛的进展，但要深入了解石墨烯材料对酶分子和蛋白质的功能和结构特性的影响，还需要进行广泛的研究工作。例如，评估石墨烯基纳米材料的物理化学特性和功能化类型对酶取向和固定化效率的影响，有助于了解纳米结构材料与酶的协调，从而开发出优化的纳米生物催化系统。探索低成本和简单的方法来合成具有特殊表面功能和物理化学性质的石墨烯基纳米材料，同时选择合适的固定化技术，无疑会设计出具有广泛生物应用的有效纳米生物催化系统。构建具有生物相容性的石墨烯纳米材料，其对环境的影响很小，毒性可以忽略不计。深入这一领域的研究，将扩大石墨烯辅助的多功能纳米生物催化系统在酶工程、生物转化、生物燃料、能源生产、以及基于酶的生物传感和生物分析应用等领域的利用。

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