磁性固相萃取原位衍生化核壳结构磁性氧化石墨烯纳米复合材料用于准确定量化人血清中的游离睾酮和雄烯二酮

游离雄激素是多种疾病的重要指标，准确测定血清中这些激素具有重要的临床意义。然而，由于游离雄激素在血清中含量极低、干扰复杂，且具有较高的血清蛋白结合率和非特异性结合率(NSB)，使用质量法对其准确定量仍有许多挑战。

本文建立了一种结合磁性固相萃取（MSPE）和原位衍生的HPLC-MS/MS方法，同时准确地测定人血清中两种游离雄激素——游离睾酮(FT)和游离雄烯二酮(FA4)。使用超滤法测定血清中游离雄激素。采用表面活性剂和硅烷偶联剂对超滤膜进行双重改性，以降低NSB率并获得准确的结果。对测试样品也进行了多次预饱和。使用上述方法后，FT的超滤回收率高达95.4%，FA4的超滤回收率为94.0%，因此NSB可以忽略不计。使用MSPE，超滤液中极低水平的游离雄激素被提取和富集，核壳结构的氧化铁被氧化石墨烯包裹。用盐酸羟胺对分析物进行衍生化，反应发生在吸附剂表面。对提取和衍生化条件进行了优化。在此条件下，FT在2-100 pg mL-1范围内、FA4在5-500 pg mL-1范围内呈线性变化。运行内和运行间FT的CV分别小于12.3%和10.9%，FA4的分别小于7.2%和8.3%。对于运行内和运行间的准确性，FT的平均相对误差分别为9.9%和8.4%，FA4的分别为11.5%和7.3%。FT的MSPE原位衍生化总提取回收率为93.2%，FA4的为93.8%，内部标准的为95.7%。结果验证了该方法的有效性，并应用该方法准确定量了疑似多囊卵巢综合征(PCOS)女性患者血清样品中这两种游离雄激素的微量水平。结合其他临床指标，有望提高PCOS的诊断准确性。

图1. 不同方法的回收率。对照组：不采用膜预处理作为对照。(A)用水冲洗膜。(B)用待测样品预饱和膜。(C)用2% Tween-80和(D) 5% Tween-80改性膜。(E)用2% Tween-80对膜进行改性，并用待测样品对膜进行预饱和。

图2. 预饱和模式对回收率的影响。

图3. 不同改性试剂对回收率的影响比较。

图4. 衍生条件的优化。衍生试剂、反应基质和酸度对(A) FT和(B) FA₄反应的影响。(C)反应温度对响应的影响。(D)衍生时间优化。

图5. MSPE条件的优化。(A) MGO量、(B)酸度、(C)离子强度和(D)吸附时间对响应的影响。

图6. MSPE总体方案示意图。

图7. 有代表性的色谱图。

图8. 比较不同组女性在AMH水平方面FT、TT、FA₄和TA₄的浓度。

相关研究成果由北京大学第三医院药学系、北京大学治疗药物监测与临床毒理中心Xianhua Zhang等人于2022年发表在Journal of Chromatography B (https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2022.123188)上。

原文：Magnetic solid phase extraction followed by in-situ derivatization with core–shell structured magnetic graphene oxide nanocomposite for the accurate quantification of free testosterone and free androstenedione in human serum。