ACS Appl. Mater. Interfaces：石墨烯量子点中含氧和含氮基团的协同效应:高弛豫红光双模磁共振成像造影剂

Applied Materials & Interfaces：石墨烯量子点中含氧和含氮基团的协同效应:高弛豫性红发射双模磁共振成像造影剂

研究背景

磁共振成像(MRI)中的造影剂(CAs)通常会改变水质子的弛豫时间(T₁或T₂)。然而，CAs中的钆离子(Gd³⁺)通常具有肾毒性。幸运的是，增强CAs的弛豫性可以有效的降低Gd³⁺的剂量，同时达到相同的图像对比度。根据Solomon−Bloembergen−Morgan理论，CAs的弛豫度主要由CAs的电子弛豫时间、Gd³⁺与水分子的配位稳定性以及CAs旋转的相关时间决定。因此，平衡Gd³⁺配位稳定性(降低解离性Gd³⁺的浓度)和增加配位水分子数量(增强弛豫性)对高弛豫低毒CAs的结构设计至关重要。

研究出发点

碳纳米结构（如碳纳米管、石墨烯量子点(GQDs)和碳点）具有sp²−sp³杂化结构以及多样性的表面基团，其独特的界面特性为平衡Gd³⁺位稳定性和增加配位水分子数量提供了潜在的解决方案。然而，由于GQDs表面和边缘结构的高度复杂，人们对GQDs与Gd³⁺之间的界面相互作用知之甚少。因此，对界面相互作用机理的深入理解就显得尤为重要。

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基于此，中国科学院上海微系统与信息技术研究所丁古巧团队和董慧团队确认了石墨烯量子点用于高弛豫性和低毒性CAs的结构设计的O-和N-基团之间协同效应的关键因素。他们选择O/N比为0.4的氮掺杂石墨烯量子点（NGQDs）构建高弛豫磁共振成像（MRI）-荧光双模CAs。通过含O-和N-基团的协同配位，可以提高Gd³⁺的配位稳定性。同时，含O和N基团的协同配位可以缩短水配体的驻留时间，并实现高弛豫。得到的CAs（称为NGQDs-Gd）显示出在114 μT的32.04 mM^-1的高弛豫。同时，NGQDs-Gd也发射红色荧光（614 nm），这可以实现与CAs一样的MRI-荧光双模成像。此外，还评估了NGQDs-Gd的生物毒性和肿瘤靶向性，并且NGQDs-Gd在体内MRI荧光成像中显示出潜力。文章以“Synergistic Effect of Oxygen- and Nitrogen-Containing Groups in Graphene Quantum Dots: Red Emitted Dual-Mode Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents with High Relaxivity”发表在Applied Materials & Interfaces上。

图文解析

透射电子显微镜（TEM）显示NGQDs-Gd的晶格间距为0.31 nm，对应于石墨的[1120]晶格边缘（图1B）。NGQDs-Gd分布在SiO₂/Si衬底上的的原子力显微镜（AFM）表征（图1C）。NGQDs-Gd的N 1s和O 1s光谱显示，530.6和531.7 eV处的峰值对应于C−O和C=O(−COOH)键，398.2和399.9 eV附近的两个峰可以被识别为C−N(−NH₂）和C=N键。在将Gd³⁺与NGQDs连接之前，398.7、400.2、530.8和531.9 eV处的峰值可被认为是由C−N、 C=N、 C−O以及C=O键（图1D）。将Gd³⁺与NGQDs连接后，N 1s和O 1s光谱中的峰面积不变，表明−NH₂和−COOH丰度依旧很高，没有变化。

图1.（A）NGQDs-Gd的TEM图像;（B）NGQD-Gd的高分辨率TEM图像;（C）NGQDs-Gd的AFM图像;（D）NGQDs和NGQDs的N 1s和O 1s XPS光谱。

计算纵向弛豫率(r₁)可以用线性拟合的方法，将弛豫率(1/T₁)绘制成Gd³⁺浓度的函数。在ULF, NGQDs-Gd的r₁值为32.04±1.43 mM^-1s^-1。NGQDs-Gd在7 T时的r₁值为12.21±0.13 mM^-1s^-1(图2A)，均高于商用CAs的弛豫率。因此，为了达到相同的对比，可以减少高弛豫度CAs的使用(从而减少Gd³⁺的摄入)。换句话说，使用NGQDs-Gd可以降低Gd³⁺的摄入量。浓度为0.28 mM的NGQDs-Gd水溶液1H核磁弛豫色散(NMRD)谱图（图2B）表明：根据Solomon−Bloembergen−Morgan理论对数据进行拟合NGQDs-Gd的r₁值由内球和外球弛豫贡献。与商用的CAs弛豫性相比（图2C），NGQDs-Gd在较宽的磁场强度范围内具有较高的弛豫性。红光发射的NGQDs-Gd的最大发射波长为614 nm，激发波长为484 nm。NGQDs-Gd水溶液的归一化紫外-可见吸收光谱在277和511 nm处观察到的吸收带分别代表π−π*跃迁(sp²结构域NGQDs-Gd)和N−O键(图2D)。对NGQDs-Gd进行光磁稳定性测试，在储存90天后仍保持稳定的磁光特性（图2E）。

图2.(A) NGQDs-Gd水溶液在ULF和HF下的r₁；(B) NGQDs-Gd在Gd³⁺浓度为0.28 mM时的¹H NMRD谱图；(C) NGQDs-Gd、商用的CAs和其他报道的CAs的弛豫性研究；(D) NGQDs-Gd水溶液的PL、PL激发光谱和紫外可见(UV – vis)吸收光谱；(E) NGQDs-Gd在磁性和光学方面的稳定性。

当O/N比为0.04、0.2、0.4、0.93、2.8、4.7、10.8和85.7时，1/T₁值分别为1.2、3.0、6.4、3.4、2.4、1.9、1.3和0.7 s^-1。当O/N比从0.04增加到0.4时，1/T₁也会增加。当O/N比为0.4时，NGQDs-Gd达到最高的1/T₁(图3A)。NGQDs官能团与Gd³⁺配合的吉布斯自由能变化(ΔG)（图3B）。ΔG越低，热力学稳定性越高。选择不同的界面结构来研究潜在的协同效应;在−COOH和−NH₂的协同作用下，碳纳米结构对Gd³⁺表现出较强的热力学配位能力(ΔG =−103.3±53.1 kJ mol^-1)。同时，在Solomon−Bloembergen−Morgan理论中，较短的水配体停留时间和整个分子旋转相关时间会增加弛豫性。因此，在上述协同协调下，将实现较高的1/T₁。可以进一步制备不同含氧/含氮基团、相同O/N比(0.4)的NGQDs-Gd-x(8≤x≤11)来验证之前的结果。当表面基团为−COOH和−NH₂时，NGQDs-Gd比NGQDs-Gd-x表现出更高的1/T₁(8≤x≤11)(图3C)。

图3.(A) NGQDs-Gd和NGQDs-Gd -x(1≤x≤7)不同O/N原子比的1/T₁值；(B)不同O/N为0.4的NGQDs结构以及不同NGQDs结构与Gd3+配合的吉布斯自由能变化(ΔG)；(C)不同含氧/含氮基团、相同O/N比(0.4)的NGQDs-Gd和NGQDs-Gd-x(8≤x≤11)的1/T₁值。

NGQDs-Gd的生物相容性。当培养基中NGQDs-Gd浓度为200 μg mL^-1时，成纤维细胞可存活72 h，且细胞存活率无明显波动，表明细胞存活率稳定（图4A）。当NGQDs-Gd浓度分别为0、100、200、300和400 μg mL^-1时，成纤维细胞的OD/OD0分别为1.00、1.00、0.99、0.99和0.98(图4B)。这些结果证明NGQDs-Gd具有较低的体外生物毒性。为了研究NGQDs-Gd的体内毒性，他们进行了血清生化(图4C)和组织学分析(图4D)。与对照组比较，NGQDs-Gd水溶液注射2 mg kg^-1及更高剂量48 h后裸鼠的肝毒性指标(碱性磷酸酶，ALP;天冬氨酸转氨酶，AST;血清谷丙转氨酶，ALT）和肾毒性指标(尿酸，UA;肌酐、CR;血尿素氮，BUN)均无明显变化（图4C）。此外，裸鼠肝脏毒性指标和肾毒性指标在长期(2 ~ 21天)内也无明显变化。同时，两组小鼠的肝、肺、脾、肾、心脏均未见明显的细胞坏死、凋亡和组织炎症(图4D)。因此，NGQDs-Gd具有较高的磁松弛性和较低的生物毒性，具有应用于MRI的潜力。然后用7.0 T MRI扫描仪观察NGQDs-Gd的MRI表现。在注射NGQDs-Gd (1 mg kg^-1，图4E)前和注射45min后分别获取包含肿瘤的横断面t1加权图像。由于使用NGQDs-Gd, t1加权图像上的肿瘤部位更亮。它更容易区分肿瘤和健康组织。结果表明NGQDs-Gd可明显提高MRI图像的对比度，有利于临床诊断。

图4.(A)成纤维细胞与200 μg mL^-1NGQDs-Gd孵育0至72小时的成纤维细胞存活率；(B) NGQDs-Gd浓度为0至400 μg mL^-1的成纤维细胞孵育48小时的成纤维细胞存活率；(C) NGQDs-Gd对裸鼠体内肝功能的影响；(D)尾静脉注射NGQDs-Gd 24 h后小鼠不同器官组织切片；(E)带有和不带有NGQDs-Gd的荷瘤小鼠7.0 T MRI图像。

图5A为成纤维细胞与MW-115细胞共培养的共聚焦显微图;只有MW-115被FA-NGQDs-Gd标记(红圈)，而正常成纤维细胞不吸收FA-NGQDs-Gd，说明只有肿瘤细胞MW-115吸收FA-GQDs-Gd并发出红光。用其他肿瘤细胞和体细胞评价FA-GQDs-Gd的标记率。MDA-MB-231、SGC7901、SKOV3、SGC996、HCC827、PC3、8305C和WM-115的标记率分别为98.7、97.7、99.9、97.7、95.7、98.9、96.4和97.5%(图5B)。此外，成纤维细胞、293A、BEAS-2B、HFF、MRC-5、HSF、HUVEC、HSKMC的标记率分别为1.2、2.9、2.4、1.3、2.4、5.7、4.7、5.7和10.0%。因此，NGQDs-Gd能有效结合各种类型的FR-阳性肿瘤细胞，但缺乏与FR-阴性细胞的结合能力。200 μg mL^-1浓度的FANGQDs-Gd孵育的MW-115细胞的荧光强度随时间的推移而下降。FA-NGQDs-Gd作用180 h后，肿瘤细胞的荧光强度仍达到最高荧光强度的一半（图5C,D）。FA-NGQDs-Gd(红色)、二乙酸酯(绿色)、DAPI(蓝色)和FR (紫色)染色的WM-115细胞共聚焦显微镜图像（图5E）。静脉注射FA-NGQDs-Gd (2 mg kg^-1)2h后，FA-NGQDs-Gd转移到肿瘤部位。注射12h后，FA-NGQDs-Gd主要集中在肿瘤部位附近，且在肿瘤附近，小鼠平均荧光强度高于正常组织（图5F）。

图5.(A)成纤维细胞和WM-115细胞与FA-NGQDs-Gd在200 μg mL^-1浓度下共培养48小时的共聚焦图像;(B) FA-NGQDs-Gd对体细胞和肿瘤细胞的靶向率;(C) 200 μg mL^-1FA-NGQDs-Gd分别孵育WM-115细胞1、4、8、24、72和144 h的FA-NGQDs-Gd通道图像；(D) 200 μg mL^-1浓度FA-NGQDs-Gd孵育WM-115细胞后，荧光强度随时间的变化;(E) 200 μg mL^-1浓度FA-NGQDs-Gd孵育WM-115细胞48 h的共聚焦图像。;(F)分别经尾静脉注射2 h和12 h后获得裸鼠靶向肿瘤荧光图像。

总结与展望

在这项工作中，含O-和含N-基团的协同作用不仅使NGQDs-Gd稳定，而且缩短了水配体的停留时间和整个分子的旋转相关时间，在114 μT下r₁为32.04 mM⁻¹s⁻¹。红光发射的NGQDs-Gd具有优良的光致发光(PL)特性，可在体内作为MIR-荧光双模CAs。FA-NGQDs-Gd与FA结合作为肿瘤靶向配体后，其肿瘤靶向率高达95%以上。因此这篇文章不仅展示了GQDs在高性能CAs方面的潜力，而且对传统基于Gd的CAs的结构设计也有一定的帮助。

文献链接：https://doi.org/10.1021/acsami.2c12719