Environmental Science Nano: ZnO纳米颗粒和石墨烯量子点对秋水异弯藻的单一和联合纳米毒性

研究背景

海洋微藻处于海洋中营养层的底部，是重要的初级生产者。它们在海洋生物的食物链中发挥着不可替代的作用，维护着海洋生态的平衡。近年来，随着工程纳米颗粒（ENP）在纺织、电子、显示技术等领域的广泛应用加速了其通过空气排放和污水排放释放到环境中。这些人造来源的ENP会在发展中不可避免地从环境中释放出来，其中的大部分将流入海洋，与海洋生态系统中的生物体相互作用。另外，无机纳米粒子nZnO因其光催化性能和紫外吸收特性而受到了广泛的关注和广泛的应用。 其几乎可以用于任何科学技术领域，并且，全球nZnO年生产规模估计为5.5-28,000吨。但近些年的研究表明，有机体暴露于 nZnO 也会对有机体产生不利影响。

研究出发点

石墨烯量子点（GQDs）作为零维纳米颗粒具有优异的化学、物理和生物性能。但是，关于碳材料对海洋微藻影响的许多研究集中在氧化石墨烯、C₆₀、多壁碳纳米管和石墨烯复合材料，关于GQDs对海洋微藻的毒性作用的研究报告很少。另外，以往的研究主要集中于单个ENP对微藻的毒性，这不能反映海洋中的真实情况。因此，应不断探索ENPs对微藻的复合毒性。目前，关于nZnO和GQDs的复合毒性的报道很少，需要补充和完善。

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基于此，中国海洋大学王江涛教授团队为了研究氧化锌纳米颗粒（nZnO）和石墨烯量子点（GQDs）对秋水异弯藻的联合毒性，进行了生长抑制试验。通过测量藻类细胞密度和活性氧（ROS）、总蛋白（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和三磷酸腺苷（ATP）的终点来探讨纳米颗粒对微藻的毒性机制。结果表明：nZnO和GQDs均抑制秋水异弯藻的生长，且毒性作用随颗粒浓度和培养时间的增加而增加。纳米颗粒通过增加活性氧的相对水平对秋水异弯藻产生氧化应激，从而抑制蛋白质合成，显著提高SOD和ATP活性以及MDA含量，以抵抗细胞氧化损伤并维持细胞能量代谢。通过扫描电镜观察到nZnO和GQDs在细胞上的聚集和覆盖导致细胞损伤。并且发现，在低浓度下，两种纳米颗粒的联合毒性低于相应浓度的单个纳米颗粒。在高浓度下，联合毒性表现出协同效应。

文章以”Single and combined nanotoxicity of ZnO nanoparticles and graphene quantum dots against the microalga Heterosigma Akishiwo“为题发表在Environmental Science: Nano上

图文解析

将ENPs添加到秋水异弯藻培养物中，通过微藻密度来研究其对细胞毒性影响。结果表明：随着nZnO浓度的增加，藻细胞密度逐渐降低，表现出时间依赖性和剂量依赖性（图1A）。同时，暴露于1、3、5和10 mg L^-1 nZnO的秋水异弯藻在第4天的生长抑制率（IR）分别达到17.1%、21.2%、55.9%和74.1%（图1B）。

图1.在4d内不同浓度的nZnO对微藻细胞密度（A）和生长控制率IR（B）的影响。报告值为3个重复的平均值±标准差。不同的小写字母表示在同一时间对照和测试浓度之间存在显著差异（a<0.05和b<0.01），下同。

水溶液中纳米金属氧化物释放的金属离子被认为是产生纳米毒性效应的一个重要因素。通过进行Zn²⁺暴露来研究nZnO对秋水异弯藻的作用机制。结果表明：Zn²⁺暴露抑制了藻细胞的生长，且抑制作用随离子浓度的增加而增强（图2A）。同时暴露于0.5、1和2 mg L^-1 Zn²⁺的秋水异弯藻在第4天的IR分别达到47.1%、67.1%和67.3%（图2B）。

图2.在4d内不同浓度的Zn²⁺对微藻细胞密度（A）和IR（B）的影响。

与nZnO相比，GQDs在测试浓度下对海洋微藻的毒性作用较低。然而，暴露于高浓度GQDs 1天后，仍然观察到藻类细胞密度显著下降（图3A）.在20 mg ^L-1的GQDs作用4天后，最高IR为63.5%（图3B）。

图3.在4d内不同浓度的GQDs对微藻细胞密度（A）和IR（B）的影响。

通过研究ENPs对秋水异弯藻细胞相对ROS水平的影响表明：藻细胞暴露于不同浓度的nZnO或GQDs 4天诱导产生大量活性氧自由基，对细胞造成一定程度的氧化损伤，并激活藻细胞中的抗氧化和非氧化酶系统。活性氧的相对水平与纳米颗粒的类型有关，并随着纳米颗粒浓度的增加而逐渐增加。在相应浓度下，nZnO的相对ROS水平通常高于GQDs，表明nZnO暴露下的氧化应激更高（图4A、B）。

图4.在第四天暴露于不同浓度nZnO（A）和GQDs（B）的秋水异弯藻的相对ROS水平。

将ENPs填入培养基4天后，TP和SOD的含量以及MDA和ATP的酶活性的变化如图5所示。图5A表明：5 mg L^-1的nZnO浓度显著抑制了20.1%的蛋白质合成，5 mg L^-1的GQDs浓度抑制了16.4%的蛋白质合成。图5B表明：当微藻培养物暴露于不同浓度的nZnO或GQDs时，观察到SOD活性显著增加（p<0.05）。MDA含量对nZnO和GQDs浓度呈阳性反应。在10 mg L^-1浓度下，nZnO诱导的微藻MDA水平在第4天显著升高（p<0.05），其值是对照的1.4倍。同时，GQDs诱导的MDA水平在5 mg L^-1时明显增加，达到对照的1.3倍（图5C）。两种ATP酶的活性随着nZnO和GQDs浓度的增加而增加。两种ATP酶在nZnO或GQDs暴露10 mg L^-1时达到最大活性。K⁺Na⁺-ATP含量分别是对照的2.2倍和2.6倍，Ca²⁺Mg²⁺-ATP含量分别是对照的4.5倍和4.3倍（图5D,E）。

图5.在4天时间内，秋水异弯藻暴露于不同浓度的nZnO或GQDs的总蛋白（A）、SOD（B）、MDA（C）、K⁺Na⁺-ATP（D）和Ca²⁺Mg²⁺-ATP（E）值。

通过扫描电镜的形态学观察，进一步确定了两种纳米颗粒对秋水异弯藻的生物毒性。未经处理的细胞看起来完好无损，没有任何细胞破坏，而经纳米颗粒处理的细胞被破坏，观察到细胞溶解和损伤（图6）。纳米颗粒与微藻相互作用形成团聚体，造成损害。之前的研究表明：nZnO可以直接穿过细胞膜进入藻类细胞。由于GQDs独特的形态和理化性质，其可以包裹在藻类细胞周围。在图6C-F中，暴露于浓度为5 mg L^-1的nZnO的微藻细胞比暴露于GQDs的微藻细胞破裂更严重。

图6.在4天时间内，暴露于5 mg L^-1 nZnO和GQDs的藻类细胞的SEM图像。A：对照组；B：A的局部扩大；C：5 mg L^-1 nZnO；D：C局部增大；E：5mg L^-1 GQDs；F：E的局部放大。圆形代表放大的区域，矩形代表nZnO的粒子，三角形代表GQDs的粒子。

根据nZnO和GQDs对微藻单独作用结果，选择1和10 mg L^-1 nZnO和5和20 mg L^-1 GQDs作为纳米颗粒在(1+5)、(10+5)和(10+20)mg L^-1不同暴露浓度下的混合毒性浓度。为了排除不同批次的影响，在相应的浓度下，将单个纳米颗粒重新暴露为复合纳米颗粒。图7显示了暴露于混合纳米颗粒4 d后微藻的细胞密度和IR。单独暴露nZnO和GQDs对藻类细胞的IR分别为17.1%、74.1%、41.2%和63.5%，混合暴露(1+5)、(10+5)和(10+20)mg L^-1纳米颗粒4 d后，抑制率分别为7.1%、23.5%和82.4%。

图7.在4天的时间内，nZnO（1，10 mg L^-1） 和GQDs（5，20 mg L⁻¹） 在单一和共存条件下对微藻细胞密度（A）和IR（B）的影响。

为了进一步研究两种纳米颗粒混合作用微藻的毒性机制，与单一纳米颗粒培养相比，我们研究了藻细胞内相关酶活性的变化情况，如图8所示。各试验组4 d时的相对ROS水平均高于对照。(10+20)mg L^-1 nZnO和GQDs处理4 d后，细胞内ROS含量增加至对照的3.8倍左右，表现出明显的协同效应。(1+5) mg L^-1 nZnO和GQDs暴露浓度下ROS值最低，为对照组的1.65倍。为进一步证实高ROS水平引起的脂质过氧化损伤，测定了TP、MDA含量以及SOD、ATP酶活性(图8B-F)。除(1+5)mg L^-1 nZnO和GQDs外，所有纳米材料浓度对TP均有显著抑制作用。TP含量最低达到0.6 mgprot mL^-1 ((10+5) mg L^-1 nZnO和GQDs)。SOD活性随浓度增加呈增加趋势。(1+5)、(10+5)和(10+20)mg L^-1 nZnO和GQDs对SOD活性的增强分别为对照的1.01、1.05和1.16倍。在所有混合浓度的nZnO和GQDs下，MDA含量均显著高于对照组(图8D)。当nZnO和GQDs浓度从(1+5)mg L^-1增加到(10+20)mg L^-1时，MDA在第4天从4.8 nmol mgproton^-1增加到5.2 nmol mgproton^-1。与对照组相比，（10+20）mg L^-1 nZnO和GQDs下，K⁺Na⁺-ATP活性分别增加到2.6倍和Ca²⁺Mg²⁺-ATP活性显著增加到4.9倍。赤潮藻的总蛋白质含量随着混合纳米颗粒暴露浓度的增加而显著降低，这与本研究中研究的不同抗氧化酶的活性呈负相关。

图8.在4天时间内，不同浓度的nZnO和GQDs在单一和混合条件下对微藻的抗氧化系统反应(A: ROS, B:总蛋白，C: SOD, D: MDA, E: K⁺Na⁺-ATP, F: Ca²⁺Mg²⁺-ATP)。

由于1 mg L^-1的GQDs对微藻没有明显影响，所以选择此浓度的GQDs来研究Zn²⁺和GQDs对微藻的联合毒性作用。GQDs的引入似乎可以减轻Zn²⁺对微藻的不利影响（图9）。暴露于0.5 mg L^-1 Zn²⁺的藻类的IR为47.1%，随着GQDs的加入，IR降低到35.3%。在1 mg L^-1和2 mg L^-1Zn²⁺处理下，IR分别为67.1%和67.3%，而当Zn²⁺和GQDs共同暴露时，IR分别下降到58.8%和60.0%。

图9.在4天的时间内，Zn²⁺（0.5，1，2 mg L⁻¹） 和GQDs（1 mg L⁻¹） 在单一和共存条件下对微藻细胞密度（A）和IR（B）的影响。

总结与展望

本文通过藻类生长抑制试验研究了nZnO和GQDs对微藻的毒性。结果表明：这两种纳米颗粒都抑制了微藻的生长，其作用呈剂量和时间依赖性。与GQDs相比，nZnO对秋水异弯藻的毒性作用更强，这可能与nZnO相对较高的表面电位和Zn²⁺的释放有关。两种纳米粒子均诱导产生过量氧化物并激活细胞抗氧化防御系统，导致SOD和ATP活性增强，MDA含量增加，从而抵抗细胞氧化损伤，消除过量ROS，维持正常的细胞形态和代谢。两种纳米颗粒的联合毒性并不等于每种单一纳米材料的简单总和，这主要是由于GQDs对金属离子的吸附以及两种纳米颗粒之间的团聚和沉降。发现低浓度时具有拮抗作用，高浓度时具有协同作用，纳米颗粒的综合毒性在很大程度上取决于所用浓度。

文献链接：https://doi.org/10.1039/D2EN00246A