Toxicology Letters：使用mRNA测序对四种石墨烯量子点（GQDs）进行体内毒性评估

背景介绍

石墨烯量子点(GQDs)是一种新型的石墨烯衍生纳米粒子(NPs)，其横向尺寸通常在10nm以下，在量子约束效应和边缘效应的诱导下表现出更好的电子、光学、自旋和光电性能。GQDs因其高生物相容性、可调光致发光(PL)、光依赖抗(亲)氧化活性和内在过氧化物酶样催化活性而在生物医学应用中前景广阔。最近的两项研究发现，GQDs可以特异性地分解淀粉样蛋白(即α-突触核蛋白原纤维、胰岛淀粉样多肽(IAPP))，降低帕金森病的神经毒性，并改善IAPP相关症状。尽管大多数研究都阐明了GQDs具有良好的生物相容性，并且在生物体中是低毒的，但关于GQDs的潜在毒性，仍有一些不一致的研究结果，这可能是由于合成方法和不同的表面特征引起的，比如纳米尺寸、表面电荷、官能团、元素掺杂、杂质等因素。然而，目前基于体内毒性评估的GQD毒性数据仍然很少。

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基于此，成都中医药大学附属四川省骨科医院邓顺研究员团队检测了斑马鱼胚胎在四种GQDs暴露下mRNA的表达变化，其中包括原始石墨烯量子点(R-GQDs)、氧化石墨烯量子点(GOQDs)、羧基石墨烯量子点(C-GQDs)和胺基石墨烯量子点(A-GQDs)。首先，分别用四种GQDs的三种浓度(50、100和200μg/mL)处理胚胎，发现只有A-GQDs在100和200μg/mL时引起胚胎发育停滞，存活率和心跳速率显著降低，畸形率升高。接下来，分析了在四种100μg/mL GQDs七天的暴露下斑马鱼胚胎的mRNA测序数据，发现所有GQDs都能作用于钾(K⁺)和钙(Ca²⁺)通道，以及具有不同程度调控作用的剪接体。与其他GQD相比，A-GQD可以通过激活与补体和凝血系统、细胞粘附分子(CAM)和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）相关的大多数基因来强烈扰乱抗凝蛋白C(PC)途径。总之，该研究提供了大量转录组学数据，支持各种类型的GQDs诱导的常见信号通路，并指出了A-GQDs对止血系统的特异性毒性。文章以“In vivo toxicity assessment of four types of graphene quantum dots (GQDs) using mRNA sequencing”为题发表在Toxicology Letters上。

图文解析

TEM图像显示四种GQDs尺寸分布窄，单分散性好（图1A）。晶格条纹显示出其晶格间距(d=0.21 nm,0.24 nm)的石墨结构，对应于石墨的(100)衍射面。XPS全谱扫描数据显示,GOQDs是最复杂的纳米粒子组成的原子比例，同时C-GQDs只包含C1s和O1s(图1B)。此外,该研究对A-GQDs的N1s谱做了一个XPS谱扫描，并分为三个强峰N-H(~399.2 eV),N-C=O(~399.7 eV),和NHⁿ⁺(400.8 eV)。接下来,ZETA电位分析显示,四种GQDs在三种介质中都带负电荷(图1D),包括ddH2O，PBS和DMEM。在四种NPs中，C-GQDs在三种介质中引起的ZETA电位变化最弱，范围为−1~−5 eV。

图1. 各种GQDs的表面表征。(A) R-GQDs (a1)、GOQDs (a2)、C-GQDs (a3)、A-GQDs (a4)的TEM图像。(B) GQDs的宽扫描XPS光谱。(C) 四种GQDs的C1s和O1s谱图。(D)四种GQDs在超纯水、 PBS和DMEM三种介质中的ZETA电位。

接下来，对斑马鱼胚胎进行发育毒性评估。斑马鱼的胚胎存活率在R-GQDs、GOQDs和C-GQDs三种浓度（50、100和200 μg/mL）下暴露时并没有明显的变化，但用100和200 μg/mL的A-GQDs处理时，从4 dpf显著降低(图2D)。在A-GQDs处理组中，相对于对照组和其他GQDs处理组，在6 dpf发现了许多异常胚胎，PE和SBD是A-GQDs处理的主要畸形性状。3 dpf时，所有GQDs处理的斑马鱼胚胎的心率没有显著变化(图2E)，但与对照组相比，在4 dpf条件下，暴露于100和200 μg/mLA-GQDs的胚胎的心率显著降低(图2F)。

图2 不同GQDs处理下斑马鱼胚胎发育毒性评价。(A-D)按2~7dpf计算存活率，每个GQDs处理3个重复(每个重复50个胚)，（A）R-GQDs, （B）GOQDs,（C）C-GQDs,（D）A-GQDs。在每个处理的3个独立重复(每个重复n = 6-8个胚胎)上，使用自动计数器在3 dpf (E)和4 dpf (F)下计算心率。

然后该研究进行了全转录组分析。首先，对不同处理的mRNA-seq数据进行主成分分析(PCA)。不管mRNA数据如何，A-GQDs的PC1评分明显不同于其他三种GQDs处理。对照组、GQDs和C-GQDs的mRNA表达数据集在PCA评分图的PC2轴上近距离聚集，而R-GQDs的PC2评分与上述3个处理略有偏离，但未达到显著水平(图3A)。在校正后的p值(FDR)<0.05和2个截止设置(fold changes (FC)，FC>1.5))下，筛选出对照组与不同GQDs处理之间的2组DEGs。A-GQDs诱导的DEGs数量最多(FC>1.5,4796)，远远超过其他三种GQDs处理诱导的DEGs总量(图3B)。为了找出不同治疗方法共有的转录组反应，基于四种GQDs处理的DEGs数据进行Venn分析，FC截止值>1.5，显著FDR值< 0.05，并且四种GQDs处理共同检测到75个DEGs。

图3 RNA-seq数据分析。(A)不同符号表示的不同处理之间mRNA表达谱的PCA分析。(B)以FDR值<0.05和>1.5倍变化(FC)为基础，对照和不同GQDs处理之间差异表达基因(DEGs)的统计结果，红色和黑色柱表示上调和下调的mRNA数量。(C)不同GQDs处理的DEGs的Venn分析。

基因本体论(GO)功能分析。阈值为FDR < 0.05时，发现A-GQDs处理组有500多个亚类显著富集。相比之下，C-GQDs(66)、GOQDs(48)和R-GQDs(48)处理中显著富集的GO项较少。在A-GQDs和GOQDs处理组的前10个的GO项中，有两个共同的GO项——“细胞对未折叠蛋白的响应和未折叠蛋白的响应”(图4A)。为了更好地探索不同GQDs通常引发的基因本体论和相关DEGs，基于从不同处理中总结出的显著富集的基因本体论项进行了Venn分析，发现四种GQDs共同引发了两个基因本体论项——“离子膜转运”和“离子转运”(图4B)。基于这两个基因本体论项，Venn分析发现四个GQDs在每个GO项共有6个和10个DEGs(图4C和D)，最终从这些DEGs中确定了8个基因，包括gria4b、kcnt1、kcnn1a、cacna1ba、kcnma1a、cacna1db、abcc5和apoa4b.2(图4E)。除apoa4b.2表达上调外，其他与钾(K⁺)和钙(Ca²⁺)通道相关的基因均被4种GQDs显著抑制。为了检测离子通道相关基因的转录变化是否干扰了离子稳态，该研究使用Fluo-3 AM探针检测了所有处理的钙信号的变化，发现与对照组相比，4个GQDs处理的荧光强度下降，但没有达到显著水平(图4F,p>0.05)。虽然钙和钾水平的变化与ATP能量的产生密切相关，但在对照组和不同GQDs处理之间，ATP水平没有显著变化(图4G)。然而，与对照相比，在GOQDs和A-GQDs处理中，CAMKIIα蛋白表达明显减弱，而CAMKIIα是一个负责钙稳态和糖原代谢的关键基因(图4H和I)。

图4 基因本体(GO)分析了不同GQDs处理诱导的DEGs。(A)从每个GQDs处理中概括出的前10个GO项FDR值均< 0.05。(B)基于各自GQDs处理显著富集的GO项的Venn分析，以及分别对GO项“离子膜转运”(C)和“离子转运”(D)中诱导的重叠DEGs数量的Venn分析。(E)通过热图描述(C)和(D)中筛选出的重叠基因的总结。(F)斑马鱼胚胎暴露于各种GQDs (100 μg/mL, 6 dpf)下的钙水平检测。(G)不同GQDs (100 μg/mL,6 dpf)处理斑马鱼胚胎细胞后产生ATP的量。(H)蛋白质印迹分析不同GQDs(100 μg/mL,6 dpf)下整个胚胎提取组织CAMIIα的表达水平。(I)根据WB波段的综合强度将CAMIIα的相对表达量与β-tublin归一化。

KEGG信号通路分析。与不同GQDs处理的GO富集趋势相似，A-GQDs处理组发现了11条KEGG信号通路显著富集，高于其他GQDs处理的KEGG信号通路总数(图5A)。在A-GQDs治疗中富集的“MAPK”和“细胞粘附分子(CAM)”涉及超过200个DEGs，这两种通路在炎症信号传导中具有重要作用。该研究对四种GQDs通常诱导的75个DEGs进行了整体通路分析(图3C)，结果显示，在三个生物重复中，对照组和处理组的表达谱一致(图5B)。为了探究这些重叠的基因之间是否存在相互作用，接下来进行了GO和KEGG分析，确定了“蛋白质N-乙酰氨基葡萄糖转移酶”和“RNA加工”为显著富集的GO项，“剪接体”为唯一显著富集的KEGG信号通路。因此，对这些重叠的基因进行了交互分析，结果显示，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子11(srfs11)是基因交互网络中高度互联的节点(插入表见图5C)，中心介导因子与其他剪接因子协同调控下游基因，包括nktr、hspbp1、rbm5、gpatch8和arglu1a。

图5 不同GQDs处理诱导DEGs的KEGG信号通路分析。(A)每种GQDs处理中得到的显著富集的KEGG信号通路，都被筛选出来，FDR值均< 0.05。(B)四种GQDs处理重叠DEGs的热图绘制。(C)四种GQDs处理共有的信号通路，从在线String数据库和Cytoscape 3.8.0中提取，插入表显示了不同基因的相互连接节点。

A-GQDs对止血系统的破坏作用。通过上述功能分析，发现A-GQDs相对于其他三种GQDs能够触发较强的转录组应答，并以A-GQDs处理中显著富集KEGG通路的DEGs为基础建立了基因互作网络。如图6A所示，该网络主要由两个簇(Cluster 1和Cluster 2)组成。Cluster 1是补体和凝血系统相关基因的集合，而Cluster 2是涉及MAPK、CAMs和凋亡信号的混合组。值得注意的是，上述途径的DEGs与抗凝蛋白C(PC)途径密切相关，后者通过维持血管屏障的完整性和保护宿主免疫系统应对血管炎症，在血管止血中发挥多功能作用。PC信号通路中典型基因proca、f5、f7、thbd、c3a、c5a等在100 μg/mL A-GQDs中高度上调，而该通路中少数基因被其他GQDs显著上调(图6B)。PC通路通常与造血转录因子相互作用以维持血管止血。例如，内皮细胞Fli1的缺乏会导致多个血栓的形成和外周血血小板数量的显著减少。因此，研究了Tg (Fli1: EGFP)转基因斑马鱼胚胎在4d时以100 μg/mL不同GQDs暴露的Fli表达(图6C)，发现与对照组和其他GQDs处理相比，A-GQDs处理4 dpf胚胎的相对荧光强度(RFI)增加了(图6D)，但没有达到显著水平(p = 0.062)。

图6 A-GQDs暴露于斑马鱼胚胎诱导的毒性途径。(A)A-GQDs在100 μg/mL浓度下诱导的基因相互作用网络图，通过在线String工具和Cytoscape 3.8软件的联合分析，推断出两个基因簇。(B)热图显示100 μg/mL A-GQDs触发的抗凝蛋白C(PC)通路的基因簇，对照与处理之间的显著变化如下:*FDR < 0.05，** FDR < 0.01，*** FDR < 0.001。(C)暴露于不同GQDs (100 μg/mL)的4dpf胚胎(fli: EGFP)躯干血管的体内成像。(D)对照组和不同GQDs在100 μg/mL时的相对荧光强度(RFI)比较。

利用qRT-PCR和WB检测A-GQDs止血毒性。为了验证A-GQDs对止血的不良影响，该研究首先通过qRT-PCR检测PC通路和凋亡信号通路的9个基因mRNA的变化。结果显示，A-GQDs几乎所有基因都以剂量依赖性的方式转录上调，发现即使在低浓度(50 μg/mL)，A-GQDs也能显著诱导proca和plg(图7A)。接下来，还对暴露于其他三种GQDs(200 μg/mL)下的斑马鱼胚胎中的9个基因进行了qPCR分析，发现这些基因中很少有显著激活的。接下来，从A-GQDs诱导的DEGs推导出的基因互作网络显示，凋亡通路与PC通路相互连接(图6A)，然后用暴露于四种100 μg/mL GQDs的斑马鱼胚胎检测凋亡启动子CASP8的水平，发现(100 μg/mL) A-GQDs处理CASP8的表达水平高于对照组和其他GQDs处理(图7B-C)。

图7 qPCR分析和WB分析。(A) 9个与PC通路和(促)凋亡信号相关的标记基因，包括proca、c3a、f5、plg、thbd、vcam1、tgfb2、fli1、fas和cox4。每个处理设4个生物重复。(B-C)蛋白质印迹法检测不同GQDs (100 μg/mL)处理的斑马鱼胚胎CASP8表达水平。

总结与展望

该研究表明所有GQDs都能诱导与离子通道(K⁺/Ca²⁺)和剪接体相关的基因簇的转录变化。与其他三种GQDs相比，A-GQDs通过激活PC通路及下游凋亡信号通路对体内系统表现出更强的毒性作用。这一发现为不同GQDs引起的共同和特定的转录组反应提供了有价值的见解。

文献链接：https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2022.05.006