文献Club| Adv. Mater.| 水溶液中超灵敏的石墨烯等离激元中红外生物传感

Ultrasensitive mid-infrared biosensing in aqueous solutions with graphene plasmon

Citation:Adv. Mater., 2022, 10.1002/adma.202110525.

一作：Chenchen Wu

通讯作者：Qing Dai

【背景介绍】

通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)识别水溶液中的纳米级生物分子为探索生物活性分子的结构、反应和传输提供了一种原位和非侵入性的方法。然而，水强而宽的红外吸收压制了生物分子各自的振动指纹。本文利用具有石墨烯等离激元的可调红外透明微流体系统来识别生理条件下约2 nm厚的蛋白质分子。获得的原位可调谐的通过背景减除消除石墨烯等离激元热点之外的水的红外吸收成为可能。重要的是，石墨烯等离激元热点分布高度有一定限制(~15 nm)允许实现纳米级灵敏度。最后，在水溶液中表征氘对单层蛋白的影响。可调谐石墨烯等离激元增强FTIR技术为研究纳米级水溶液中的生物过程提供了一个新平台。

图1.可调谐的石墨烯等离激元增强红外光谱平台

【工作创新点】

本文开发了一种可调谐的石墨烯等离激元增强FTIR技术，以识别生理条件下的纳米级蛋白质。通过在FTIR测量中通过门控执行原位背景扣除方法，可以消除石墨烯等离激元热点之外的H₂O干扰，实现纳米级灵敏度(低至~2 nm 厚的蛋白质)，可以直接监测水溶液中的蛋白质氢/氘交换过程。

【结果与讨论】

图1a中展示了石墨烯等离激元装置和红外透明微流体系统组成，高红外透射率是实施石墨烯等离激元增强FTIR测量的基础。为了在水性FTIR测量中实现高IR透明度，选择 200 μm 厚的氟化钙(CaF₂)晶体作为顶部窗口，而SiO₂/Si基底支持石墨烯等离激元器件作为微流体室的底部窗口。石墨烯纳米带区域（100 μm×200 μm）的微流控室高度设计为小于5 μm，以确保溶液的稳定流动，以及FTIR测量的高红外透明度。结果，在填充蛋白质溶液后，该微流控室在石墨烯纳米带区域的IR吸光度小于0.6（图 1b 中的蓝色曲线）。

通过电子束光刻和氧等离子体蚀刻将基板上的石墨烯图案化为宽度在50 nm和100 nm之间的纳米带阵列。在石墨烯上蒸镀一对带有钛粘附层的金电极作为源漏接触，而在石墨烯外蒸镀另一个电极，起到栅极接触的作用。图1b中的红色曲线为流动1小时后用5 mg/mL蛋白质溶液测量的典型消光光谱。在宽石墨烯等离激元共振峰上可以检测到1545 cm^-1（用绿线标记）和 1655 cm^-1（用紫色线标记）的两个急剧下降。这来自石墨烯等离激元和分子振动的相消干涉。因此，在 1545 cm^-1处记录的倾角可被识别为酰胺II带，这是典型的蛋白质分子特征。然而，1655 cm^-1处的倾角位于水的 OH 弯曲模式和蛋白质的酰胺I带重叠的区域。

通过监测蛋白质在石墨烯纳米带上的吸附过程来研究提出的 GP-aIR生物传感器的检测限。当蛋白质溶液注入GP-aIR生物传感器时，蛋白质分子逐渐吸附在石墨烯纳米带上，最终在20分钟内达到饱和状态。为了更清楚地展示等离激元增强的分子信号，如图 2a 所示。在注入蛋白质溶液开始时（0 分钟），由于水的 OH 弯曲模式，在 1645 cm^-1 附近只能记录一个宽峰。随着吸附时间变长（注入蛋白质溶液 7 分钟、8 分钟、16 分钟、20 分钟），酰胺 II 带 (~1545 cm^-1) 获得的 IR 响应出现并不断增强，如绿色所示箭。 1645 cm^-1 附近的 IR 响应蓝移至 1655 cm^-1，可识别为蛋白质的酰胺 I 带（紫色箭头）。从图2b可以看出，随着吸附时间的增加，石墨烯纳米带的高度从~2 nm增加到~8 nm，这证实了蛋白质分子逐渐吸附在石墨烯纳米带上。如图 2d 所示，蛋白质吸附使石墨烯费米能级向狄拉克点移动。它开始变化很快，然后变化速度变慢，最后达到饱和吸附。电学结果显示的变化规律和饱和吸附所需的时间证实了GP-aIR生物传感器的消光光谱。

图2.超高灵敏度蛋白质识别

研究蛋白质骨架的氢与其周围溶剂之间的 H/D 交换过程的相互作用速率和位点不仅反映了蛋白质的折叠状态及其动力学，而且反映了基础氨基酸序列的内在化学性质。本文证明了可调谐石墨烯等离激元增强 FTIR 平台可以直接监测水溶液中纳米级蛋白质分子的 H/D 交换。最初，GP-aIR 生物传感器与蛋白质溶液（H₂O）一起流动 1 小时，以达到蛋白质分子在石墨烯纳米带上的饱和吸附。随后，将 D₂O 注入微流体系统半小时，以确保蛋白质的完全 H/D 交换。然后，交替注入 H₂O 和 D₂O 几次，同时测量石墨烯等离激元的消光光谱。为了比较，在图 3a 中提取并公开了等离激元增强的蛋白质反应。获得的光谱中最明显的变化是酰胺II带对应的1545 cm^-1峰消失，用D₂O代替H₂O在1457 cm^-1出现一个新峰，重新注入H₂O后恢复，这为 H/D 交换提供了直接证据。根据文献，1457 cm^-1 处的峰归属于氘化蛋白的酰胺 II 带，由 N-H/D 弯曲和 C-N 拉伸模式的耦合引起（图 3b）。然而，1457 cm^-1 处的峰强度远大于 1545 cm^-1 处的峰强度，这可能与 D₂O 中的 H-O-D（弯曲模式为 1457 cm^-1）有关。

此外，研究了采用不同浓度（17%、34%、51%、68%、85%）的D₂O对溶液中蛋白质分子结构的H/D交换过程。收集它们在每个浓度下的消光光谱，同时提取等离激元增强信号并绘制在图 3c 中。与 H₂O 中的消光光谱相比，酰胺 I 波段（约 1655 cm^-1）和酰胺 II 波段（约 1545 cm^-1）的强度都随着 D₂O 浓度的增加而降低。最重要的是，H/D交换比与H₂O/D₂O比一致，表明纳米级蛋白质的H/D交换过程高效发生并达到动态平衡。原因是纳米级蛋白质具有较大比例的暴露于环境的表面结构。从这个结果，本文的方法表现出高检测灵敏度，可以监测纳米级蛋白质的质子交换过程。

图3.由GP-aIR 生物传感器监控的 H/D 交换过程

【结论】

本文采用可调谐石墨烯等离激元增强 FTIR 平台，调整石墨烯等离激元以识别生理条件下的纳米级蛋白质指纹。石墨烯等离激元的高度受限的光场和可调谐性可以从根本上增强光物质相互作用并减少水干扰，从而将灵敏度降低到约2 nm 厚蛋白质的值。同时，在 GP-aIR 生物传感器的帮助下展示了蛋白质分子结构上的动态和可逆的 H/D 交换。该为在复杂生理条件下以超高灵敏度实施原位研究生物过程铺平了道路，这为研究纳米生物界面提供了新的策略。