Journal of Materials Chemistry B:N掺杂石墨烯量子点在第二近红外窗口光热消除多重耐药细菌中的应用

背景介绍

致病菌严重威胁公众健康，每年导致全球近2000万人死亡。目前在临床治疗细菌感染时滥用抗生素已导致多药耐药(MDR)细菌的广泛存在。除了抗生素的滥用外，MDR细菌对抗生素的耐药性通常源于生物膜的形成。由于抗生素进入生物膜的渗透速度慢，有效浓度低，大多数抗生素一旦形成就无法消除细菌生物膜。以往报道的抗菌药物仍存在生物相容性低、环境危害大、成本高、耐药等问题。光热疗法(PTT)被认为是一种有效的替代传统方法来对抗抗生素耐药细菌感染的方法。使用PTT试剂和近红外(NIR)激光产生局部热能具有无创、低系统毒性和可控性等独特优点。与被广泛研究的NIR-I窗口相比，NIR-II激光具有更高的最大允许曝光量和更深的穿透深度。因此，需要寻找具有NIR-II光热性能的新型PTT试剂来促进抗菌PTT的发展。

研究出发点

石墨烯量子点作为一种纳米级的石墨烯衍生物，由于其极小的尺寸、优异的光学性能和良好的生物相容性而在各个领域得到了广泛的应用。与贵金属基纳米材料相比，小尺寸的特性降低了石墨烯量子点的长期毒性，很容易从体内清除。这些特性促进了它们在生物成像、生物传感器、药物输送、光动力学治疗和PTT。最近，田等人提出了自己的观点。通过一锅水热法合成镍掺杂碳点(CDs)作为NIR-II响应性PTT试剂，而金属离子的引入可能诱发潜在的长期毒性。因此，开发不掺杂金属离子的NIR-II响应型GQD是迫切而又具有挑战性的。

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上海大学潘登余老师团队和李平老师团队首次报道了高度石墨化氮掺杂的GQD(N-GQD)，由硝基冠烯和支化聚乙烯亚胺(BPEI)通过超快微波反应合成了N-GQD(方案1)。较高的石墨氮掺杂量(3.6 at.%)使N-GQD在808 nm和1064 nm处的光热转换效率分别达到77.8%和50.4%。对于耐多药细菌(MRSA)和非耐药细菌(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)，所获得的N-GQDs加NIR-II激光显示出广谱抗菌活性、生物膜消除和促进感染伤口愈合能力。

方案1.N-GQD的合成方法及其在多药耐药细菌感染的光热辐射中的应用示意图

图文解析

透射电子显微镜(TEM)测得N-GQD的平均尺寸为5.0±0.7 nm(图1a)。此外，HRTEM显示晶格间距为0.21 nm，对应石墨结构的(100)面 (图1b)。X射线衍射显示N-GQD在约22°处有一个宽的(002)峰，证明了N-GQD具有类石墨化结构(图1d)。进一步用AFM研究了N-GQD的形态，表明N-GQD的平均厚度为1.2±0.3 nm（图1c）。未掺杂N的GQD的吸收光谱仅限于可见光和紫外区，在近红外区没有明显的吸收。

图1.(a-c)N-GQD的TEM、HRTEM和AFM图像；(d-f)N-GQD的X射线衍射谱、拉曼光谱和红外光谱；(g)N-GQD的XPS谱。

黑色N-GQD溶液表现出强烈而稳定的发光性质，在365 nm的灯照射下显示出强烈的青色荧光，最佳发射和激发波长分别为450 nm和350 nm(图2a，b)。N-GQD的激发无关发光行为可能归因于它们的高结晶度。另外，图3c表明N-GQD在pH为2～10或连续照射5h后具有良好的荧光稳定性，不会发生光漂白现象。

在808 nm和1064 nm激光照射下，初步研究了N-GQD的浓度依赖性光热效应。在808 nm和1064 nm激光照射下，N-GQD的温度分别从26.8 ℃和66.2 ℃上升到67.9 ℃和66.2 ℃(图2c)。红外热像也被用来评估N-GQD的温度升高(图2j)。此外，通过将808和1064 nm激光的功率分别从0.1和0.2改变为0.5和1.0 W/cm²，验证了N-GQD的良好的光热效应(图2d，f)。

图2.(a，b)N-GQD的近红外吸收光谱、荧光光谱和荧光激发光谱；(c，e)在808 nm和1064 nm激光照射下N-GQD的温升；(d，f)在不同功率密度的808和1064 nm激光照射下，N-GQD(200μg/mL)的温升；(G)N-GQD在激光照射十个周期内的温度变化；(h，i)N-GQD的光热转换效率测量；(j) 808或1064 nm激光连续照射下的红外热像。

在确认了N-GQD良好的光热效应的基础上，进一步通过10个周期的激光关闭/开启来评估其光热性能的稳定性。经10次激光照射后，N-GQD水溶液的升温温度没有明显变化(图2g)，表明它们具有良好的光热稳定性。测量了N-GQD的光热转换效率，以进一步研究其光热性能。在监测了辐照和非辐照过程中的温度后(图2h，i)，测得N-GQD(200微克/毫升)在808和1064 nm处的光热转换效率分别为77.8%和50.4%。

图3.(a，b)在接受不同浓度N-GQD水溶液处理后的菌落和存活率的代表性培养图像；(c)通过测量595 nm的吸光度来量化(d)中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的生物量；(d)玻片上耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜结晶紫染色图像；(e，f)各组MRSA的活/死染色和扫描电子显微镜图像。

探索了N-GQD作为光热抗菌剂的潜力，初步评价了N-GQD的细胞毒性和溶血率等生物相容性。将不同浓度的N-GQD与BEAS2B细胞孵育，用CCK-8比色法评价N-GQD的生物相容性。结果表明，不同浓度的N-GQD均未检测到明显的细胞毒作用。N-GQD在高浓度(400 μg/mL)时的溶血率仅为4.0%，证明N-GQD具有良好的生物相容性。然后，选择了三种典型的致病菌，其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌为非耐多药细菌，MRSA为耐多药细菌，对N-GQD的光热抗菌活性进行了评价。在有或没有激光照射的情况下，在LB琼脂糖基上形成的MRSA集落数量相似(图3a，b)，这表明只有没有添加N-GQD的激光对MRSA的生长没有影响。此外，在没有激光照射的情况下，N-GQD没有检测到明显的抗菌作用，显示出MRSA与N-GQD孵育后形成的菌落。而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的存活率随N-GQD浓度的增加而逐渐降低，说明N-GQD的抗菌活性主要来源于光热效应。在近红外激光照射下，N-GQD(200 μg/mL)处理的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的存活率低于3%，说明N-GQD具有良好的光热抗菌作用。

然后，以SYTO9和PI为探针，通过活/死染色实验研究了N-GQD的光热抗菌机理。如图3e显示，在对照组、N-GQD单独组和808或1064 nm激光单独组均可明显观察到强烈的绿色荧光，表明N-GQD和近红外激光单独作用都不会影响细菌的生长。而N-GQD+808或N-GQD+1064组有明显的红色荧光，揭示细胞完全死亡。此外，在金黄色葡萄球菌中也观察到了类似的结果。通过扫描电子显微镜观察了细菌在光热抗菌过程中的形态变化。在对照组、单纯N-GQD组、单独808或1064 nm激光组，可以观察到完整的细胞形态和光滑的表面(图3f)，而在NGQD+808组和N-GQD+1064组中，MRSA、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的表面明显变得粗糙、皱缩和皱折，说明N-GQD的光热效应是通过破坏细胞膜结构来杀灭细菌的。

进一步研究了1064 nm激光照射下N-GQD的体内光热抗菌治疗。感染MRSA的小鼠可观察到严重的细菌感染，伤口处有黄色脓液。将感染小鼠随机分为对照组、1064 nm激光照射组、N-GQD组(200µg/mL)和N-GQD(200µg/mL)+1064 nm激光照射组(1.0W/cm2)。红外热像图显示，1064 nm激光单独照射组和N-GQD+1064组创面周围局部温度分别上升至39.8 ℃和50.1 ℃(图4c)，证实了N-GQD的显著光热效应。细菌感染创面的愈合情况如图4a所示，第1、2、3组12天后创面未愈合，第4组创面明显愈合，提示在1064 nm激光照射下应用N-GQDS可明显促进创面愈合。通过检测创面组织中CFU的数量来评价光热抗菌效果。图4b显示，在6d时，第4组的CFU数量明显少于其他组，说明在1064 nm激光照射下，N-GQD对MDR细菌具有很强的抗菌性能。采用HE染色和Masson染色进行组织学分析，进一步观察治疗效果。图4d显示对照组、N-GQD单独给药组和1064单独给药组有大量炎性细胞。而N-GQD+1064组术后12天可见炎性细胞减少，新生血管增多，表明创面基本愈合。Masson染色显示，N-GQDS+NIR组的胶原纤维较其他组更连续，提示N-GQD在近红外激光照射下取得了更好的创面修复效果(图4e)。这些结果清楚地证实了N-GQD具有优异的光热抗菌活性。

图4.(a)治疗0、2、4、6、9和12天后MRSA感染皮肤的照片；(b)(a)所述组织的细菌菌落照片；(c)近红外辐射前后经PBS或N-GQds处理的小鼠的红外热像图；(d，e)感染皮肤组织的H&E和Masson染色图像。

结论与展望

以硝基冠烯和BPEI为前驱体，通过超快微波反应合成了高度石墨化的N掺杂GQD。较高的石墨化氮掺杂量(3.6 at.%)可以将N-GQD的吸收扩展到NIR-II区，使N-GQD在808 nm和1064 nm处的光热转换效率分别达到77.8%和50.4%。细胞毒性试验和溶血试验证实N-GQD具有良好的生物相容性。在1064 nm激光照射下，N-GQD对耐多药细菌的抗菌和抗生物被膜效率几乎达到100%。体内抗菌实验表明，NGQDS在NIR-II窗口具有光热清除细菌感染的能力，从而在MRSA感染的小鼠皮肤创伤模型中实现了加速伤口愈合。

文献链接：https://doi.org/10.1039/D2TB00192F