Analytical Chemistry:基于碳量子点功能化溶液门控石墨烯晶体管的超灵敏无标记DNA检测

背景介绍

脱氧核糖核酸是一种生物大分子，是生命系统遗传信息的载体。由于生物体中DNA序列的浓度极低，开发从大摩尔水平到零摩尔水平的高灵敏、可靠和成本效益高的无标记DNA生物传感器是具有挑战性的。通常，脱氧核糖核酸生物大分子可以使用荧光平台、比色法、扫描开尔文探针显微镜和电化学设备进行检测和分析，但这些方法不易实现。场效应晶体管(FETs)由于其简单的结构和可提高检测限(LOD)的电放大功能，在生物传感器中也得到了广泛的应用。在不同类型的FET生物传感器中，溶液门控石墨烯晶体管(SGGTs)因其工作电压低于1v而引起人们的广泛关注。与其他通道材料相比，化学气相沉积(CVD)生长的单层石墨烯具有高载流子迁移率、高比表面积、优异的生物相容性和化学稳定性，增强了生物传感器的性能。

研究出发点

目前，基于SGGTs的DNA检测方法正在发展中。在纳米级到原子级范围内。CVD石墨烯的质量、探针的固定位置以及探针的修饰方法都会影响到LOD。具有两个大面积退栅极的SGGTs的平面结构和在CVD石墨烯通道上适当密度的DNA探针使LOD降低到原子水平(25 aM)。碳量子点(CQDs)表面具有丰富的官能团，是一种很好的生物识别连接剂。为了提高生物传感器的性能，在生物传感器的许多应用中设计了多种类型的CQDs。然而，用于DNA检测的CQDs荧光技术的检出限为17.4 nM。

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基于此，湖北大学李金华教授以木质素磺酸钠和对苯二胺为起始原料合成CQDs，并提出了一种新的CQDs功能化的SGGTs，用于Fe³⁺和Cu²⁺离子的检测。在本工作中，作者制作了一种基于SGGTs的无标记DNA生物传感器，该传感器具有CQDs的功能化门，具有超高的灵敏度和良好的特异性。用巯基的巯基乙酸(MAA)修饰金栅电极表面的量子点。然后，通过强π-π相互作用，将末端未修饰的无标记ssDNA探针直接固定在CQDs表面。LOD可达1 aM，比之前报道的其他方法低2 ~ 5个数量级。该传感器在1 aM ~ 0.1 nM范围内具有良好的线性关系，具有良好的特异性。它能有效区分单碱基错配的ssDNA靶标。对于1 aM的目标DNA分子，反应时间约为326 s。文章以“Ultrasensitive Label-Free DNA Detection Based on Solution-Gated Graphene Transistors Functionalized with Carbon Quantum Dots”为题发表在Analytical Chemistry上。

图文解析

图1a为合成的CQDs的透射电子显微镜(TEM)图像。CQDs为球形纳米颗粒。图1b为CQDs的高分辨率TEM (HRTEM)图像。可以看出，CQDs具有良好的结晶性，晶格间距约为0.33 nm，这与石墨的(100)面有关。图1c为CQDs的傅里叶变换红外(FTIR)光谱。如图1d所示，CQDs的X射线光电子能谱(XPS)验证了官能团元素的存在。在284.22、398.77和531.25 eV处有三个峰值，分别为C 1s(53.82%)、N 1s(8.62%)和O 1s(26.68%)。结果表明，制备的CQDs主要含有氧、氮和碳元素。红外光谱(FTIR)和XPS测定结果表明，制备的CQDs主要由羟基、氨基和羧基官能团组成。这些官能团是用于探针固定的功能化金栅电极的重要连接物。

图1：CQDs的(a) TEM图像。(b)HRTEM图像。(c)FTIR光谱。(d) 全量程XPS测量谱。

图2a为器件和杂化识别过程。使用湿化学转移方法将CVD生长的石墨烯转移到源电极和漏金电极的表面作为导电通道。图2b显示了CQDs使金栅电极功能化和固定ssDNA探针的过程。由于CQDs不能直接固定在Au栅极上，因此使用MAA和EDC/NHS连接CQDs。图2c展示了杂交的识别过程。ssDNA探针捕获ssDNA靶。当单抗单链DNA靶分子加入后，核酸发生杂交，然后双链DNA (dsDNA)链在静电排斥作用下从单抗量子点表面脱附。

图2：DNA传感器结构示意图和杂交识别过程。(a)基本设备的制造。(b)金栅电极上的CQDs修饰和ssDNA探针固定化过程。(c)杂化和双链DNA链从量子点表面解吸的识别过程。

图3a为DNA传感器的测量示意图。安装在设备上的PDMS是附加测试试剂和PBS电解质溶液的容器，PBS电解质溶液覆盖栅极和导电通道，以保证与电解质溶液的固定接触面积。VGS和VDS是加在栅极和漏极上的电压，参考源极。在栅极电压作用下，栅极/电解液和电解液/石墨烯界面形成了两个双电层(EDLs)。对应的两个平行板电容等效电路如图3b所示。电位降如图3c所示。当ssDNA探针被固定后，栅极电位将变为V ‘(蓝色虚线)。当DNA靶加入到PBS溶液中，它会与DNA探针杂交形成dsDNA。dsDNA会从CQDs中分离出来。栅极电位将变为V″(红色虚线)。图3d显示了将ssDNA探针固定在Au栅极上和加入ssDNA靶前/后DNA传感器的转移曲线。在pH值为7.4的PBS溶液中测量DNA传感器的转移曲线，发现器件的狄拉克点向负栅电压轴方向偏移。由于DNA分子是电负性的，它相当于在栅极上施加一个负电压(ΔV^eff)。

图3：(a) CQDs功能化的SGGT DNA传感器的配置。(b)两个EDLs的示意图。(c) SGGT器件在栅极电压V_GS下的电位降。(d)将探针ssDNA固定在栅电极上和加入DNA靶前/后器件的转移曲线。

此外，还研究了狄拉克电压位移与ssDNA靶浓度的定量关系。图4a为加入不同浓度ssDNA靶标后设备的转移曲线。可以看出，随着ssDNA靶浓度的增加，转移曲线向更高的栅极电压转移。这是因为随着目标DNA的加入，杂化的dsDNA分子不断地从CQDs中脱落出来。重要的是，传输只沿栅电压轴移动，而不沿通道电流轴移动。这意味着通道电流的变化仅仅是由转移曲线的水平位移引起的。因此，通道电流的变化只能与靶DNA的浓度有关。我们可以通过测量通道电流来计算DNA靶的浓度实现实时测量。图4b显示了DNA生物传感器的狄拉克电压位移(ΔV_Dirac)作为目标ssDNA (Log C_DNA)对数浓度的函数。图4c显示了添加不同浓度的目标DNA后生物传感器的通道电流响应。可以看出，该传感器的LOD可以达到1 aM，比之前的研究低了2-5个数量级。有趣的是，I_DS显示了目标DNA与CQDs上的探针ssDNA杂交的过程，杂交后的dsDNA从CQDs表面脱落。当目标DNA分子加入PBS溶液时，I_DS先增加后减少，并逐渐达到一个稳定值。I_DS的更改对应三个过程。首先，目标DNA分子与探针ssDNA分子杂交。这相当于施加在栅电极上的负电压。因此，在开始阶段，I_DS增加。然后，目标DNA与探针ssDNA杂交，形成的dsDNA将从CQDs的表面脱落。这相当于施加在栅电极上的正电压。I_DS将会减少。最后，随着所有附加的目标DNA分子的杂交完成，I_DS将趋于稳定。因此，我们可以监测I_DS的变化，进而监测DNA杂交和DNA从CQDs表面脱落的过程。从这个意义上说，可以实现对DNA的实时检测。图4d显示了传感器的通道电流(ΔI_DS)作为不同浓度互补DNA (Log C_DNA)的函数的变化。可以看出，该传感器在1 aM ~0.1 nM范围内呈现良好的线性检测范围，R²为0.978。

图4:(a)加入不同浓度的互补DNA后，固定了ssDNA探针的传感器的转移曲线。(b) DNA传感器的狄拉克电压位移(ΔV_Dirac)是目标DNA浓度的对数浓度(Log C_DNA)的函数。(c)传感器对添加不同浓度的互补DNA (V_DS= 0.1 V和V_GS= 0.1 V)的通道电流响应。(d)传感器的通道电流(ΔI_DS)随不同浓度的互补DNA (Log C_DNA)的变化。

如图5a所示，采用非互补ssDNA (UN-Com)、9碱基错配ssDNA (9-Mis)、3碱基错配ssDNA(3Mis)、单碱基错配ssDNA靶标(1-Mis)和互补ssDNA (Com)靶标测量通道电流响应。与完全互补的DNA靶相比，当前对干扰的响应非常低。在这些干扰中，1-Mis ssDNA靶表现出最大的电流响应。然而，由于杂交后不稳定的双螺旋结构，1-Mis靶基因的通道电流响应比完全互补的DNA靶基因低8倍。说明该生物传感器对目标DNA具有良好的特异性。图5 b显示了转移曲线CQDs功能化 SGGT传感器6 h。该装置测量在PBS溶液测试每2 h。传感器的转移曲线显示了一个小变化6 h。这意味着制造设备显示稳定性好,有利于检测。

图5:(a)检测非互补DNA靶标(UN-Com)、9碱基错配DNA靶标(9-Mis)、3碱基错配DNA靶标(3-Mis)、单碱基错配DNA靶标(1-Mis)和互补DNA靶标(Com)的通道当前响应(ΔI_DS)。(b)CQD功能化的SGGT生物传感器在PBS溶液中不同时间的转移曲线。

总结与展望

综上所述，作者报道了CQDs功能化的SGGT被成功开发用于DNA检测。LOD可达1 aM，比其他方法低2 ~ 5个数量级。该传感器在1 aM ~ 0.1 nM范围内具有良好的线性关系。它能有效区分单碱基错配的目标DNA。该DNA传感器在1aM浓度下的响应时间为326 s，可以对超低浓度的DNA分子进行快速检测。该工作为生物传感器的应用提供了良好的前景。然而，湿转移方法导致了设备之间的均匀性问题，未来需要探索经济和高质量的石墨烯转移方法。传感器的稳定性和再现性有待进一步提高。

文献链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c05309