Adv. Healthcare Mater: 用于胃癌可视化治疗的三功能石墨烯量子点@LDH 集成纳米探针

背景介绍

癌症是一种威胁人类健康的复杂疾病。为了与之抗争，人们通过大量研究开发出了治疗癌症的有效方法，如化疗和放射治疗。然而，这两者都对人体有着极大的副作用。近年来，纳米技术为癌症的治疗提供了新的视角。随着纳米分子成像技术的发展，癌症诊断的难度逐渐降低。然而，研究时往往是分开进行诊断和治疗的。这就使得治疗效果的反馈不及时，导致了疾病的延误。因此，可视化和精确治疗相结合的方法已成为肿瘤治疗的重要趋势。

研究出发点

层状双氢氧化物(LDHs)是具有生物相容性和生物可降解性的二维纳米材料，可作为药物传递、ATP传递和DNA传递的优良载体。量子点(QDs) 是纳米荧光成像中最重要的组成部分，与MR或CT成像相比，光学成像通常更快、更便宜，而且它的空间分辨率是最高的。GQDs是具有良好的生物相容性和光稳定性的纳米材料，可作为荧光探针，广泛的应用于生物成像和肿瘤治疗中。此外，在GQDs表面一般采用静电结合或化学键连接的载药方法。缺点是这些药物将暴露在无保护的生物环境下，在运输过程中很容易逃逸到非靶组织，造成毒副作用。要克服这些困难，构建多功能纳米材料是最好的解决方案。

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基于此，同济大学汪世龙教授团队设计出了用于精确可视化治疗的可靠策略。首先采用共沉淀法制备了LDH@SGQD复合物，然后利用传统化疗药物依托泊苷(VP16)完成了胃癌综合治疗探针的设计。由于肿瘤微环境的弱酸性， LDH@SGQD-VP16很容易聚集。肿瘤部位长期稳定的荧光使其具有生物成像和效果追踪的能力。结果表明：VP16具有增强治疗和减轻副作用的作用，LDH@SGQD-VP16诱导HGC-27细胞凋亡是单独使用VP16的2.7倍。该工作为LDH@SGQD-VP16作为一种潜在的多功能胃癌可视化治疗药物提供了理论和实验依据。文章以“Trifunctional Graphene Quantum Dot@LDH Integrated Nanoprobes for Visualization Therapy of Gastric Cancer”为题发表在Adv. Healthcare Mater上。

用于癌症治疗的三功能纳米探针 LDH@SGQD-VP16 的设计。

图文解析

图1a-c显示了LDH和LDH@SGQD的TEM表征。LDH和LDH@SGQD均为六方结构，SEM表征结果相同。然而，与LDH相反，LDH@SGQD的表面有许多小黑点，它们是通过静电结合存在于LDH表面的SGQD，用HRTEM可以清楚地观察到SGQD的晶格结构，如图1c所示。动态光散射结果表明，LDH@SGQD-VP16粒子的大部分粒径分别为≈100 nm和≈30 nm，小于LDH@SGQD-VP16粒子(图1d)。图1e的XRD图显示LDH@SGQD的衍射峰的位置和强度与LDH的相同，表明SGQD的加入不影响复合材料的晶体结构。负载VP16后，衍射峰位置略有左移，LDH@SGQD-VP16峰强度明显降低，表明结晶度降低，说明VP16负载成功。LDH@SGQD和LDH@SGQD-VP16的XPS表征如图1f-h所示。在全谱分析中，可以找到五种元素：C1s(285 EV)，O1s(531eV)，Mg1s(1303 EV)，Al 2p(74)和S 2p(168)。携带VP16后，C、O比例均高于携带VP16前。由于VP16的基本结构由C和O两种元素组成，额外的C和O可能来自药物，这证明该载药系统构建成功。在紫外灯下，SGQD呈现蓝色荧光，与荧光激发/发射光谱一致。最大发射峰约为480 nm，最大激发峰约为380 nm。LDH@SGQD在紫外灯下的荧光为青色，表明其发射光谱发生了红移。LDH@SGQD的最大发射峰位于560 nm，最大激发峰位于470 nm。使用药物VP16后，其荧光光谱与LDH@SGQD的一致。与SGQD相比，其荧光光谱也出现了红移，但红移幅度小于LDH@SGQD，其最大发射峰位于540 nm，最大激发峰位于440 nm。从理论上讲，荧光的红移是可用于生物成像的。

图1. (a)LDH、(b)LDH@SGQD的TEM图像。（b）中插图：LDH@SGQD 上的SGQD。(c)SGQD在LDH@SGQD上的HRTEM。(d)LDH@SGQD和LDH@SGQD-VP16的直径分布。(e)LDH、LDH@SGQD和LDH@SGQD-VP16的XRD分析。(f)XPS光谱。(g)高分辨率的C 1s。(h)LDH@SGQD和LDH@SGQD-VP16的S 2p。(i)在365 nm紫外光下拍摄SGQD、LDH@SGQD和LDH@SGQD-VP16的照片和荧光光谱。

图2a显示了用LDH@SGQD-VP16在488 nm激发光下培养HGC-27细胞24小时的荧光成像，并用Dil在543 nm处对细胞膜进行了染色。与已报道的SGQD-VP16不同， LDH@SGQD-VP16主要聚集在细胞膜表面，少量进入细胞质，这表明复合物进入细胞的方式与SGQD不同。通常情况下，细胞吞噬后释放的物质进入溶酶体，其中酸性环境有利于LDH@SGQD-VP16的解体释放VP16。溶酶体共定位实验在HGC-27细胞中证实了这一假设(图2b)。图2a显示了用LDH@SGQD-VP16在488 nm激发光下孵育HGC-27细胞24小时的荧光成像，并用Dil在543 nm处对细胞膜进行了染色。与已报道的SGQD-VP16不同，[30]LDH@SGQD-VP16主要聚集在细胞膜表面，少量进入细胞质。这表明复合物进入细胞的方式与SGQD不同。通常情况下，细胞吞噬后释放的物质进入溶酶体，其中酸性环境有利于LDH@SGQD-VP16的解体释放VP16。溶酶体共定位实验在HGC-27细胞中证实了这一假设(图2b)。用红色荧光探针Lyso-Tracker Red标记溶酶体，合并图像的荧光在LDH@SGQD-VP16的绿色荧光的结合下变成橙色，并被吞噬后转移到溶酶体上。为了研究HGC-27胃癌的体内成像能力，首先建立了HGC-27胃癌裸鼠模型。如图2c所示，小鼠静脉注射0.1ml(9.2g·L^-1)LDH@SGQD。在1、3、6、24、48和72 h进行体内成像，在72 h 475 nm处进行内脏成像。结果表明，LDH@SGQD在注射后1h即可在肿瘤部位发现荧光，表明LDH@SGQD可通过血液循环快速靶向肿瘤组织。随着注射时间的延长，肿瘤部位的荧光逐渐增强，在肿瘤部位的滞留时间很长。注射后72h，仍可观察到荧光发射。解剖后在肝脏、肾脏和肿瘤中观察到荧光，表明LDH@SGQD是由肝脏和肾脏代谢的。通过观察可以区分肿瘤部位，靶向聚集和荧光强度使物质变得丰富和可视化。这表明LDH@SGQD可作为肿瘤可视化治疗的荧光探针。

图2. 在488 nm处，用LDH@SGQD-VP16(40mgL-1)处理HGC-27细胞3小时和24小时的CLSM图像。(a) 在543 nm处用Dil对细胞膜进行染色，比例尺：20 µm。(b)LDH@SGQD和LDH@SGQD-VP16溶酶体共定位24小时，尺寸：20 µm。在体内1、3、6、24、48和72小时的荧光图像；72小时的器官(心、肝、脾、肺、肾和肿瘤) (c)静脉注射LDH@SGQD(0.1mL，9.2gL-1)后，475 nm处可见荧光，并使用ImageJ进行荧光定量。图中数据表示平均值±SD(n=3)。显著性差异：***p<0.001。

图3a显示了使用NIH 3T3细胞的材料的安全性。结果表明LDH@SGQD可减轻VP16对正常细胞的毒副作用。当浓度增至80 mg L^-1时，细胞存活率降至约65%。为LDH@SGQD-VP16、LDH@SGQD和VP16(10、15、20、25、30、35和40 mg L^-1)与HGC-27细胞培养24 h，在40 mgL^-1时，LDH@SGQD-VP16的细胞毒作用是VP16的1.6 倍 (图3c)，这表明LDH@SGQD-VP16可以增强对HGC-27的细胞毒作用。细胞毒性试验表明，LDH@SGQD-VP16对正常细胞有保护作用，对肿瘤细胞的杀伤作用增强。这表明LDH@SGQD-VP16可以作为胃癌的治疗药物，与现有的治疗方法相比具有更好的生物相容性和更高的疗效。图3d为VP16和LDH@SGQD-VP16(分别为20和40mg L^-1)处理HGC-27细胞24h后的凋亡率，在40mg L^-1时，LDH@SQGD-VP16组细胞凋亡率显著增加，约为VP16组的2.7倍。VP16单独作用可诱导HGC-27细胞凋亡，但比例较低，且与药物浓度无关。与VP16不同，LDH@SGQD-VP16以浓度依赖方式促进HGC-27细胞凋亡。因此，LDH@SGQD-VP16可以通过促进胃癌细胞凋亡来提高胃癌治疗的效率，这在HGC-27细胞系中得到了证实。

图3 生长抑制试验。(a)将NIH 3T3细胞分别与不同浓度(20、40、80、160、320mg L^-1)的LDH、SGQD和LDH@SGQD共同培养(n=4)。(b)将LDH@SGQD-VP16和LDH@SGQD与不同浓度的VP16培养(n=4)。(c)将HGC-27细胞分别与不同浓度(10、15、20、25、30、35、40mg·L^-1)的LDH@SGQD-VP16、LDH@SGQD和VP16共同培养24h，流式细胞仪检测细胞凋亡。(d)将HGC-27细胞与不同浓度(20和40mg·L^-1)的LDH@SGQD-VP16和VP16共同培养24 h。(e)体内实验方案。(f)静脉注射后第18天各实验组(LDH@SGQD-VP16，LDH@SGQD，VP16，PBS)的HGC-27肿瘤的照片；体内抗胃癌效应。(g)肿瘤体积变化。(h)小鼠体重变化。(i)用Ki67/TUNEL(绿色)、DAPI(蓝色)对四组(LDH@SGQD-VP16、LDH@SGQD、PBS、VP16)进行细胞增殖分析(Ki67)和细胞凋亡分析(TUNEL)。比例尺：100µm。(j)用ImageJ(n=3)进行荧光面积分析。图中数据表示平均值±SD。显著性差异：***p<0.001或*p<0.05。

为评价LDH@SGQD-VP16对胃癌的体内治疗作用，将小鼠分为4组：PBS组为对照组，LDH@SGQD、LDH@SGQD-VP16和VP16实验组。如图3e所示，实验包括18天的腹腔注射，所有材料每隔一天注射一次。手动记录小鼠和肿瘤体积的重量。图3f显示了实验完成后获得的肿瘤组织，可见LDH@SGQD-VP16组肿瘤体积小于其他各组。这表明负载纳米材料后VP16的治疗效果有所提高。从图3g体积大小的定量分析发现，LDH@SGQD-VP16的抑瘤率高于VP16。这一结果与细胞毒性试验结果一致，这意味着LDH@SGQD-VP16改善了肿瘤治疗。与VP16相比，LDH@SGQD-VP16组小鼠的平均体重持续增加(图3h)。这表明VP16的副作用对机体是有害的，而LDH@SGQDVP16治疗则达到了生物安全性。图3i采用石蜡包埋切片对肿瘤组织进行免疫组织化学分析，结果表明，LDH@SGQD-VP16具有促进细胞凋亡的作用，这与体外细胞凋亡实验中观察到的趋势一致。肿瘤组织的苏木精伊红(H&E)染色中也观察到类似的结果。LDH@SGQD-VP16组肿瘤细胞数最低，其次为VP16组。测定肝肾功能指标-谷氨酰转移酶(-GT)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)，各项指标均在安全范围内。通过常规组织H&E染色进行组织安全性和病理学分析(图5)。VP16组部分肝细胞被染成暗红色，表明VP16对肝细胞有一定的损伤作用。然而，LDH@SGQD-VP16没有对器官造成任何明显的损害。这些结果表明，使用LDH@SGQD-VP16可以提高生物安全性。

图4.小鼠腹腔注射PBS、VP16、LDH@SGQD和LDH@SGQD-VP16后第18天处死小鼠，其肿瘤组织和其他器官(心、肝、脾、肺和肾)的H&E染色图像。比例尺：100µm。

总结与展望

综上所述，在癌症可视化治疗方面，本文报道了一种三功能集成的纳米探针LDH@SGQD-VP16，它结合了SGQDs的荧光成像能力、LDH在酸性环境下的肿瘤靶向特性以及药物VP16增强的治疗效果。化学表征证明LDH和SGQD是通过静电相互作用结合而成，粒径约为100 nm。与SGQD相比其荧光发射有红移，更有利于细胞和动物的荧光成像。通过FTIR和XRD特性验证，VP16成功负载，负载率为28.1%。实验结果表明VP16在体外作用于细胞，保护正常细胞免受损伤，在体内抑制肿瘤生长，促进细胞凋亡，实现肿瘤组织的靶向成像。与其他GQDs和LDH的复合物相比, LDH@SGQD-VP16的生物相容性更好,更容易准备,并且可利用荧光可视化为肿瘤位置,适合实时跟踪效果。此外，材料的荧光强度可以用来表示药物富集。因此，该系统实现了肿瘤检测、肿瘤治疗和药物跟踪的一体化。LDH@SGQD-VP16在肿瘤微环境中积累的能力，加上其荧光成像特性，使其成为一种理想的生物相容性纳米颗粒，用于诊断和治疗载体。本研究为LDH@SGQD-VP16作为肿瘤可视化治疗的新策略提供了实验依据。

文献链接：https://doi.org/10.1002/adhm.202100512