文章简介
近年来冷冻电镜领域硬件和软件的革命性突破使得该技术成为解析生物大分子近原子分辨率结构的主要方法,该技术也因此获得2017年诺贝尔化学奖。然而冷冻电镜技术依然面临一些挑战,包括样品在气液界面的变性、优势取向、成像背景噪音和漂移等问题。为了解决这些问题,具有超高导电导热性的二维材料石墨烯及其衍生物被发展为一种优越的冷冻电镜载网支持膜。近日,清华大学生命学院王宏伟教授和天津大学陈亚楠教授受邀在SmartMat上发表了题为“Structural engineering of graphene forhigh-resolution cryo-electron microscopy”的综述文章。该综述系统地总结了石墨烯以及表面被修饰的石墨烯衍生物作为冷冻电镜载网支持膜的生产、组装、性质及应用,介绍了石墨烯液封技术原位观察生物样品的优势,最后也讨论了石墨烯以及其他二维材料作为冷冻电镜载网支持膜的潜在价值。
图文导读
图1. 冷冻电镜技术在样品制备过程中的一些挑战。(A)理想情况下样品没有优势取向,均匀地分散在玻璃态冰中。(B)冰薄时样品被挤至孔的边缘。(C)样品趋向于吸附至碳膜上。(D)样品吸附在气液界面上,导致变性和优势取向。(E)样品吸附在超薄碳膜上。
图2. 石墨烯载网的组装。(A)多聚物辅助的间接转移法。(B)直接转移法。(C)无需转移石墨烯的直接刻蚀法。
图3. 石墨烯载网的代表性性质。(A)石墨烯支持膜的高分辨透射电镜图像,呈现典型的蜂窝状结构。(B)氧化石墨烯的透射电镜图像及选定区域衍射图。单层或双层氧化石墨烯衍射图分别如I、II所示。(C)修饰后和未修饰的石墨烯支持膜相对强度相近,说明官能团修饰不会显著影响石墨烯稳定性。(D)随着氢气环境下石墨烯载网亲水化时间增加,石墨烯的水接触角不断减小。
图4. 石墨烯材料载网具有更低的背景噪音以及电子束诱导的样品漂移。(A)氧化石墨烯和薄碳膜背景噪音的比较。(B)配备电压相位板和像差矫正器的冷冻电镜拍摄的一张典型的链霉亲和素显微照片。(C)均方根误差显示和碳支持膜相比石墨烯支持膜具有更微弱的样品漂移问题。
图5. 石墨烯载网上样品呈现均匀分布状态。(A)左上角显示70S核糖体在普通石墨烯载网上样品分布,其他显示在氢气亲水化处理不同时间后70S核糖体在石墨烯载网上分布情况。(B)TRPA1二维平均图显示在普通载网和石墨烯载网上呈现出不同的优势取向。(C)脂肪酸合成酶的三维平均图显示在普通载网上是不完整的,而石墨烯载网上是完整的。
图6. 石墨烯载网的官能团修饰。(A)带有His标签的样品颗粒能够被通过NTA和镍离子修饰的石墨烯载网捕获。(B)目的样品能够被官能团修饰石墨烯选择性捕获。(C)聚乙二醇-氨基氧化石墨烯(上)和共价结合亲和标签氧化石墨烯(下)示意图。(D)在石墨烯上引入不同官能团修饰的装置示意图(上)以及主要官能团种类(下)。
图7. 石墨烯液封技术原位观察样品。(A)蛋白所修饰的石墨烯包裹细菌的透射电镜显微照片。(B)荧光显微镜下细菌的活性状态。(C)通过π–π堆叠组装石墨烯液封方法示意图。
总结
石墨烯及其衍生物支持膜的超高导电导热性以及稳定性等特性,使得它在冷冻电镜样品制备过程中克服了很多难以解决的问题。这种二维材料载网支持膜的利用除了能够降低背景噪音、使样品分布均匀、选择性捕获靶蛋白外,还能够通过石墨烯液封技术原位地观察生物样品。其他二维材料如氮化硼也具备成为电镜载网支持膜的潜力。
作者简介
徐洁,博士生,2019年于清华大学生命科学学院获理学学士学位。并于2019年在清华大学生命科学学院继续攻读博士学位,师从清华大学生命科学学院王宏伟教授。研究领域为更高效、更高分辨率冷冻电镜方法学开发。
陈亚楠,博士,2012年于北京科技大学获学士学位。2017年获北京科技大学美国马里兰大学联合培养博士学位。2017年至2019年在清华大学生命科学学院任高精尖中心卓越学者。后于2019年作为特聘研究员,博士生导师加入天津大学。研究领域聚焦于纳米材料超快速合成,能源存储,能源转换以及冷冻电镜技术。
王宏伟,博士,先后于1996年和2001年在清华大学生物科学与技术系获学士和博士学位。随后在美国劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部进行博士后研究。2006年开始担任劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部研究科学家并于2009年任耶鲁大学分子生物物理与生物化学系助理教授。2011年至今任清华大学生命科学学院教授。研究领域包括更高效、更高分辨率冷冻电镜方法学开发,细胞骨架和生物膜系统的协调机制以及核酸质量控制的分子机制和调控。
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