AM：金属桥接的石墨烯-蛋白超粒子用于对一氧化氮进行数字化传感

研究背景

具有自限制生长的纳米级尺度超结构在纳米组装领域中发展迅速，其特征是由多分散的非均质组分产生单分散的中、微尺度的颗粒和纤维。超粒子(SPs)是自限制纳米组装材料中最具代表性的成员之一，它包含100-300个纳米尺度的构筑单元，其形成取决于静电斥力和范德华引力之间的平衡。SPs组分的多功能性、亚纳米级的孔隙以及整合生物亚单位的能力,促进了自限性SPs在蛋白质稳定、药物传递、光催化、手性识别和手性催化等方面的研究。

研究出发点

许多无机纳米粒子(NPs)很容易生成SPs，然而，碳纳米组分，如石墨烯NPs则不能，部分原因是由于碳原子质量小，其范德华引力相对弱于金属、半导体和陶瓷NPs的色散力。石墨烯量子点(GQDs)，由于其合成简单、相对丰度高、强光学活性和生物相容性，是SPs的理想成分。虽然GQDs可以形成一些纳米组装体，但它们自组装成单分散的SPs的挑战在于对等的排斥和吸引。

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基于此，上海交通大学樊春海院士、南方医科大学徐峰教授、和密歇根大学Nicholas Kotov发现当利用Tb³⁺离子补充范德华相互作用后，GQDs中高度均匀的SPs可以实现成功的自组装。GQDs、Tb³⁺和超氧化物歧化酶(SOD)组装的SPs对NO的选择性也高于其他活性氮(RNS)和活性氧(ROS)。此外，SPs合适的尺寸与强发光结合使通过单粒子计数进行NO检测成为可能，使数字化的分析得以实现，并进一步提高检测限。利用SPs对呼吸中NO进行快速、无创的监测，可以实现多层面的健康监测。相关成果以“Metal-Bridged Graphene–Protein Supraparticles for Analog and Digital Nitric Oxide Sensing”为题发表在Advanced Materials上。

图文解析

自上而下法制备的GQDs具有良好的分散性，其直径为2-8 nm(图1b)。由于GQDs的荧光性质与尺寸有关，GQDs的低均匀性会显著增加荧光分析中的信号误差。然而，自限制组装过程可以将多分散的NPs转化为近单分散的NPs。将GQDs与SOD组装在一起，利用GQDs的荧光和生物相容性补充蛋白质的生物学特性。自组装过程是通过添加镧系离子(特别是Tb³⁺)与石墨烯薄片边缘的羧基形成强配位键而诱导的。当仅有GQDs时，三电荷镧系离子倾向于形成分支聚集(图2a为Tb³⁺)，因为这些配位键是刚性的，表现出高的空间各向异性。而半椭球形SOD单元的柔性桥可以部分展开，极大地降低了与镧系离子的配位组装的各向异性，并将分支聚集转化为球状的SPs(图1c为Tb³⁺)。通过第一性原理计算和分子动力学(MD)模拟，揭示了支链聚集体向SPs形态转变的机理。密度泛函理论(DFT)计算表明，对于GQDs-Tb³⁺-GQDs组合，中心金属中心角Φ最佳为180°。GQDs-Tb³⁺-GQDs组装单元中的这种协调桥的几何形状迫使它们在组装过程中相互对齐，在所有尺度上传播单个块的对称性，这可以在它们优先形成链的过程中被识别出来。

图1. 以Tb³⁺为金属配位桥的GQDs和SOD形成SPs。(a) SPs形成过程示意图，(b)原始GQDs，(c)和SPs的TEM图像，(d) SPs的高分辨率TEM图像，(e) Tb³⁺离子被SOD蛋白吸收的MD模拟快照，(f) 羧基化GQDs与Glu分子之间的铽配位桥原子模型，(g) 原子模型的角度Tb³⁺配位桥之间的羧基化GQDs和SOD的Glu残基

进一步研究了不同SOD含量下GQDs-Tb³⁺-SOD的结构。只有在GQDs与SOD的比重为60:40时才会形成SPs。否则，形成的是网状聚集体，而不是SPs(图2b)。对这些不同的装配模式进行定量分析的一个常见参数是无因次尺度指数Γ(图2d)，以装配的最大与最小几何度量的比例计算当添加20% SOD时，网络纳米链的Γ从42.3明显下降到9.1。在40% SOD的临界点Γ = 2.4，随后随着SOD浓度的增加而增加。当SOD大于或等于60%时，GQDs-Tb³⁺-SOD可以观察到不规则的聚集(图2c,d)。

众所周知，SOD参与NO的代谢。受先前SOD检测NO研究的启发，使用GQDs-Tb³⁺-SOD SPs检测NO。由于组分GQDs的多分散性，SPs具有纳米级的孔隙，这有助于小NO分子快速扩散进入这些纳米组件。我们观察到，GQDs-Tb³⁺-SOD SPs不表现出强烈的荧光，因为Tb³⁺在SOD中被Cu (II)离子有效猝灭。当NO存在时，Tb³⁺的绿色荧光强度增加了35倍(图3a)，这是由于NO在SOD反应中心将Cu (II)还原为Cu (I)。进一步优化了GQDs:SOD比值，以获得更好的分析性能(图2e)。同时发现，GQDs/SOD比值为60:40，含有200个SOD单位的SPs对Tb³⁺发光的增强作用最大。重要的是，单独的GQDs和SOD都不能使Tb³⁺的荧光变化如此明显，所有的组分都需要紧密地整合到SPs中才能增强荧光，这是由于通过空间隧穿激发态能量传递的近距离(2 nm)所要求的。

图2. 优化形貌，尺寸和荧光性能。(a-c)配位纳米复合物的TEM图像，(d)纳米复合物的尺寸分散性相对于组件中GQDs的重量百分比，(e)荧光强度和荧光对组件中NO/GQDs/SOD重量百分比的响应

为了更好地理解自限制组装的能量传递过程，研究了SOD与Cu (II)由抗坏血酸还原为Cu (I)或SOD与铜离子由过量EDTA萃取的SPs的荧光性质。在1 ×10^-3 M Tb³⁺溶液中，无铜SOD的荧光强度高于原始SOD。在类似条件下，Cu (I)-SOD的荧光强度比无Cu的SOD高8.8倍。我们得出的结论是, Cu (I)离子通过刺激非辐射系统间交叉过程使Tb³⁺的荧光敏感，从而使其他对称禁止的辐射状态成为可能，类似于Ag (I)的光学效应。在SPs中，高浓度的Cu (I)和Tb³⁺使这种敏化有效。对SOD中铜离子及其周围配体的DFT计算(图3c)显示了中心Cu(II)被还原为Cu(I)后伴随的结构变化。Cu (II)反应位点具有较小的HOMO LUMO，为1.93 eV (DFT计算)，作为Tb³⁺发射的有效能量受体(2.28 eV)，并猝灭其发光(图3d)。DFT计算的Cu(I)反应位点的HOMO LUMO间隙为4.87 eV (254 nm)。这种变化对于SPs的光学性质是至关重要的，因为它与Tb³⁺在280 nm的吸收带重叠，从而允许激子能量从还原的SOD转移到镧系荧光团。此外，用于构建SPs的GQDs的HOMO LUMO间隙位于300 nm (4.13 eV)，也与Tb³⁺的相同带(4.40 eV)重叠。因此，Tb³⁺与激子能量的两个施主在物理上的紧密接近使激子能量聚集到单个发射体。

图3. NO的荧光检测方法及其机理分析。(a) SPs检测NO的示意图，(b) 光学照片，(c) DFT优化了SOD中Cu(I)和Cu(II)配位中心的结构，(d)相应的分子轨道能，(e)无Cu、Cu(I)和Cu(II)超氧化物歧化酶致敏Tb³⁺离子的荧光光谱，(f) 不同含量NO存在时的荧光光谱

进一步研究了不同NO浓度下的发光增强(图4a)，以确定该生物标记物的检测限(LOD)，算得的LOD为10×10^-12 M。同时该体系对NO的特异性较高(图4b)。为了测试该方法的广泛适用性和SPs的高灵敏度的优势，我们将这些载玻片暴露在含NO的生物液体中。每500秒将携带100×10^-12 M的NO注入体积为1 mL的微型液池中(图4c,d)。使用SPs涂层的载玻片，与CCD摄像头集成，而CCD摄像头本身与微流控设备集成，以获取单个SPs的荧光强度。可以多次读出单个SPs的响应，而不是单个分散体的体积，这代表了自限制组件相对于染料的一个相当大的优势，由于视场中有大量的SPs，导致信噪比显著提高。随着微流控装置中NO溶液的加入，单个SPs的注册信号逐步增加(图4e,f)，最终达到平台。这一系列的实验表明，使用我们的单粒子检测协议，一个SPs能对至少600个NO分子产生明显的光学响应。

图4. 用于NO检测的荧光测定的粒子计数格式。(a)基于SPs的NO荧光分析的线性图(a)和b)相应的选择性，(c,d)添加NO前和添加NO后通过共聚焦显微镜观察SPs的荧光图像，(e,f)分6次输入NO情况下两个单独的SPs的荧光强度

总结与展望

通过用镧系元素离子桥接GQDs和SODs来设计自限性纳米组装体。将多级结构组件与SPs的紧密整合和可以使得激子能量从GQDs和蛋白质有效地转移到Tb³⁺。而当Cu²⁺被一氧化氮(NO，病毒性肺部感染和阿尔茨海默病的重要生物标志物)还原为Cu(I)时，这一机制被激活。该平台可以通过显著的荧光增强来提高的NO的检测限（200倍），达到10×10^–12 M。此外，由于SPs具有均匀的尺寸大小，因此实验也可以对NO的数字化检测。通过对人体呼吸产生的NO进行成功监测，实验证明了这种基于SPs的策略具有很好的实用性。综上所述，这种具有良好生物相容性的SPs可以将蛋白质、碳纳米结构和离子成分进行有效结合，为实现高敏感分析检测提供了新的途径，有望用于对感染和其他疾病进行非侵入性跟踪。

文献链接：https://doi.org/10.1002/adma.202007900